RP－HPLC法測定傳統(tǒng)朝醫(yī)方兩儀煎中梓醇的含量

王玲玲 徐 影 金香淑 姜英子

吉林省延邊大學(xué)，吉林 延吉 133000

兩儀煎由山茱萸和地黃兩味藥材組成。本方作為傳統(tǒng)朝醫(yī)方記載于新《東醫(yī)保鑒》，根據(jù)朝醫(yī)藥理論，該制劑具有補(bǔ)腎益精的功能，用于玉莖冷痛證疾病治療［1］。近年來，金香淑等到研究兩儀煎對慢性腎功能衰竭 (CRF)患者腎功能的影響及臨床療效，實驗研究表明兩儀煎具有益腎補(bǔ)脾、化濁祛淤之功效，全方體現(xiàn)了扶正祛邪、標(biāo)本兼顧的原則［2］。

處方中的熟地黃為玄參科多年生草植物地黃 (Radix Rehmanniae)的根的炮制品，為清熱涼血藥，具有明顯的抗炎、調(diào)節(jié)免疫的功能?；瘜W(xué)成分以環(huán)稀醚萜苷類為主，主要有梓醇、二氫梓醇等。其中，梓醇為主要有效成分之一，具有降血糖、緩瀉、滋陰、抗炎和抗肝炎病毒［6］等多種生物活性［3－5］，亦是主要水溶性成分。測定其含量，可為地黃及其制劑提供質(zhì)量控制的有效手段。本實驗采用高效液相色譜法，選擇地黃以梓醇為含量控制指標(biāo)，為對兩儀煎中梓醇進(jìn)行了含量測定條件摸索，經(jīng)方法學(xué)考察及陰性對照試驗，表明此法專屬性較強(qiáng)，重現(xiàn)性好，方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高，可作為本品內(nèi)在質(zhì)量控制的有效方法。

1 儀器與試劑

日本島津LC－10A高效液相色譜儀 (包括SPD－10A紫外檢測器);奧特賽思儀器有限公司AS3120A型超聲波清洗脫氣器;TG332A型微量分析天平 (Sartorius);98－1－B型電子調(diào)溫電熱套 (天津市泰斯特儀器有限公司);梓醇購自天津金測分析技術(shù)有限公司;甲醇為色譜醇;水為超純水;其余試劑均為分析純。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取梓醇對照品適量，加流動相制成每1mL含9.5μg梓醇的混合溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備

照處方比例取熟地黃0.40g和山茱萸0.20g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入蒸餾水25ml，加熱回流提取1h和45 min，合并續(xù)濾液，濃縮至近干。用流動相超聲溶解于25 ml容量瓶中，定容，用 0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱:Diamonsil C18(5μm，250 mm×4.6 mm);流動相:乙腈－水 (1:99);流速:1.0 ml/min;柱溫為40℃;檢測波長:210 nm。在此條件下，對照品及樣品色譜圖見圖1。

圖1 HPLC圖

2.3 線性關(guān)系考察

吸取上述對照品溶液 5，10，15，20，25，30，35 μl進(jìn)樣，按上述色譜條件測定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量 (X，L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。梓醇回歸方程為:Y=2424.5X+1168.3(r=0.9995)，線性范圍為0.0475 ～0.3325 μg，見圖2。

圖2 線性關(guān)系曲線

2.4 精密度試驗

取上述對照品溶液，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量20μl，測定梓醇的峰面積，RSD(n=6)為0.70%，說明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗

照處方比例制備6個模擬批號樣品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，依“2.2”項下分別吸取供試品溶液20μL注入色譜儀測定含量，結(jié)果梓醇的平均含量 (n=6)分別為0.50mg/g;RSD為1.43%。表明本法具有良好的重復(fù)性。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取處方供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24h進(jìn)樣20μL，測定梓醇的峰面積，結(jié)果梓醇的峰面積RSD(n=6)為1.38%，表明供試品溶液在24h小時內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 加標(biāo)回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品 (梓醇0.50mg/g)，分別定量加入梓醇標(biāo)準(zhǔn)品，按“2.1.2”制備供試品溶液，依“2.2”項下色譜條件精確進(jìn)樣20μL，測定梓醇的量，計算平均回收率為100.48%;RSD為1.83%，結(jié)果見表1。

2.8 樣品含量測定

照處方比例制備5個模擬批號樣品，按“2.1.2”制備供試品溶液，依“2.2”項下色譜條件測定，梓醇的含量為0.50mg/g。

表1 回收率測定結(jié)果 (n=9)

3 討論

3.1 供試品溶液制備條件的選擇 在色譜條件選擇中，紫外掃描梓醇溶液在190～400nm的最大吸收在210 nm，與文獻(xiàn)報道［7］相同。在提取試驗中，由于是傳統(tǒng)方劑，與臨床用藥相接近，所以選用了水提取，提取時間考察了40，60，90，135min對含量測定的影響?？紤]到與臨床相符，最后選擇1小時和45分鐘為提取時間。經(jīng)重復(fù)性及加樣回收率試驗，表明本方法可行。

3.2 流動相的選擇 曾根據(jù)文獻(xiàn)報道［7］進(jìn)行了反復(fù)試驗，當(dāng)減少水的含量而增加乙腈的含量時，雖然洗脫能力增強(qiáng)，但分離度差;只有增加水的含量達(dá)到水一乙腈 (99∶1)時，梓醇峰才達(dá)到基線分離且梓醇的峰形較好，保留時間在15min內(nèi)。同時考查了不同流速 (0.8、1.0、1.2 ml·min－1)對分離結(jié)果的影響，最終以流速1.0 ml·min－1最為理想。

3.3 根據(jù)5批模擬批號樣品的含量測定，兩儀煎中梓醇的平均含量為0.50mg/g。因此，可暫定傳統(tǒng)朝醫(yī)方兩儀煎中含熟地黃以梓醇 (C15H22O10)計不得少于0.50%。

［1］崔松男．朝藥志［M］．延邊人民出版社，1995:250．

［2］金香淑，李金花，金貞姬．朝醫(yī)四象方兩儀煎對慢性腎功能竭治療作用的研究［J］．時珍國醫(yī)國藥．2007，18(1):57－58．

［3］汪程遠(yuǎn)，張浩，孟莉，等．HPLC測定地黃及其制劑中梓醇的含量［J］．華西藥學(xué)雜志，2003，182(2):134－135．

［4］顧清，唐迎雪，張建．RP－IIPLC法測定四生口服液中梓醇的含量［J］．中國藥師，2006，9(3):244．