實蠅共生菌研究進(jìn)展

柳麗君，李志紅，戴 陽

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193

昆蟲共生菌(symbiont)是指存在于昆蟲體內(nèi)特定部位的微生物，它與宿主昆蟲相互依賴、相互影響、協(xié)同進(jìn)化(Baumannet al.，1995)。宿主昆蟲為共生菌提供穩(wěn)定的小生境和營養(yǎng)成分，共生菌則幫助宿主合成自身不能合成的必需的營養(yǎng)物質(zhì)，降解宿主體內(nèi)的有毒物質(zhì)，協(xié)助宿主消化特殊食物(薛寶燕等，2004);有些共生菌(如沃爾巴克氏體Wolbachia)還可調(diào)節(jié)宿主昆蟲的生殖活動(龔鵬等，2002)，可作為病毒傳遞的媒介(馮利等，2008)。共生菌分為初級和次級2類。初級共生菌垂直傳遞，調(diào)節(jié)宿主的存活和繁殖;次級共生菌既可垂直傳遞，也可在同一世代不同個體間水平傳遞，影響宿主對環(huán)境的適應(yīng)性(譚周進(jìn)等，2005)。目前，有關(guān)昆蟲共生菌的研究主要集中在社會性昆蟲與其共生菌的共生關(guān)系上，如蚜蟲(aphid)與布克納什菌Buchnera aphidicola(Buchner，1965)、舌蠅(tsetse)與魏格沃菌Wigglesworthia glossinidia(Aksoyet al.，1997)、煙粉虱(cotton whitefly)與其共生菌(Skaljacet al.，2010;Chielet al.，2009;Zchori-Fein ＆ Brown，2002)等的共生關(guān)系。有關(guān)非社會性昆蟲共生菌的研究較少，實蠅便是其中一類。

實蠅科Tephritidae屬于節(jié)肢動物門Arthropoda昆蟲綱Insecta雙翅目Diptera，是植食性昆蟲。成蟲在寄主植物的果實內(nèi)或莖稈中產(chǎn)卵，卵在其中發(fā)育成幼蟲;幼蟲為潛食性，可形成蟲癭，為害包括果實、莖及葉在內(nèi)的多個植物器官，降低水果品質(zhì)和產(chǎn)量。其寄主范圍廣，生活周期短，繁殖力強(qiáng)，世代重疊嚴(yán)重，造成的危害大，防治困難，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和果蔬貿(mào)易造成了巨大影響，許多國家已將其列為重要的檢疫性有害生物(陳乃中，2009;吳佳教，2009)。

實蠅共生菌可作為宿主食物，參與宿主的碳氮循環(huán)，為宿主提供食物中缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，也可幫助實蠅降解食物中的有毒物質(zhì)(Robacker＆Lauzon，2002)。因此，研究實蠅共生菌，對發(fā)現(xiàn)新的實蠅誘餌、提高不育實蠅的環(huán)境適應(yīng)性，以及提出新的實蠅防治技術(shù)均具有重要意義。

1 實蠅共生菌的分布

1.1 胞內(nèi)共生菌

胞內(nèi)共生菌多是初級共生菌。它在寄主體內(nèi)的分布十分穩(wěn)定，且與宿主實蠅具有穩(wěn)定的遺傳發(fā)育一致性(Donovanet al.，2004)。該類共生菌主要分布于特定細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，這些細(xì)胞被稱為菌胞(bacteriocytes)(Buchner，1965)。

1.2 胞外共生菌

胞外共生菌多是次級共生菌。它在實蠅幼蟲階段主要分布于中腸外的突囊中;羽化出成蟲后，則主要分布于頭部的食道球內(nèi)。繼 Petriet al.(1909)發(fā)現(xiàn)了可在油橄欖實蠅Bactrocera oleae不同世代之間傳遞的共生菌——沙氏極毛桿菌Pseudomonas savastanoi后，Capuzzoet al.(2005)又詳細(xì)描述了該菌在成蟲體內(nèi)的分布和轉(zhuǎn)移情況。該菌主要分布于成蟲頭部的食道球(咽泡)內(nèi)，細(xì)菌在該器官內(nèi)迅速增殖，形成菌團(tuán)，并向中腸移動。雌性成蟲肛腺附近也富集了該類細(xì)菌，并可通過產(chǎn)卵將其傳遞到卵內(nèi)。在幼蟲階段，該菌在腸道內(nèi)增殖;其在蛹內(nèi)的精確位置尚未確定。

胞外共生菌在不同種宿主實蠅中的分布不同?；ǔ釋嵪墎喛芓ephritinae的食道球比油橄欖實蠅小，缺少細(xì)菌分布。該類實蠅共生菌主要分布于中腸圍食膜之外，與上皮細(xì)胞相連。因此，這些共生菌并不直接與食物接觸，也不參與食物在腸道內(nèi)的轉(zhuǎn)運過程(Girolami，1983)。

由于胞外共生菌主要分布于宿主實蠅體腔內(nèi)，并未完全與體腔內(nèi)的其他物質(zhì)隔離，容易被外來微生物入侵和取代，導(dǎo)致共生關(guān)系穩(wěn)固性下降。盡管該類共生菌與宿主實蠅的協(xié)同進(jìn)化現(xiàn)象不常見，但它對宿主的生物學(xué)功能卻不可忽視。

1.3 胞內(nèi)和胞外共生菌之間的轉(zhuǎn)變

胞內(nèi)和胞外共生菌的定義并不是完全絕對的，伴隨著實蠅個體的發(fā)育，共生菌也會出現(xiàn)胞內(nèi)和胞外的轉(zhuǎn)變。Capuzzoet al.(2005)在油橄欖實蠅中分離到一株內(nèi)共生菌，因其與桃色歐文氏桿菌Erwinia persicina及大黃桿菌E.rhapontici的同源性高達(dá)97%，將其命名為CandidatusErwinia dacicola。Esteset al.(2009)研究發(fā)現(xiàn)，該菌在油橄欖實蠅的發(fā)育過程中，存在由胞內(nèi)向胞外轉(zhuǎn)移的過程。在幼蟲階段主要分布于中腸胃盲囊胞內(nèi)，但在成蟲階段，到達(dá)前腸腸腔和產(chǎn)卵管后，卻轉(zhuǎn)移到胞外。該特征可使該菌在多食性、全變態(tài)宿主昆蟲的發(fā)育中保持穩(wěn)定的生存狀態(tài)。

2 實蠅共生菌種類

2.1 實蠅共生細(xì)菌

共生細(xì)菌一直是實蠅共生菌研究的重點。已報道的常見4個屬的重要經(jīng)濟(jì)實蠅共生細(xì)菌種類見表1。根據(jù)其作用，可將其分為初級共生細(xì)菌和次級共生細(xì)菌2大類。

2.1.1 初級共生細(xì)菌——WolbachiaWolbachia是一類廣泛分布于節(jié)肢動物體內(nèi)的共生細(xì)菌，通過卵的細(xì)胞質(zhì)傳播，對宿主的生殖活動起著重要的調(diào)控作用(如誘導(dǎo)胞質(zhì)不親和、殺雄、改變生殖力等)。近年來，該菌已成為國際生物學(xué)研究的熱點(施婉君等，2002)。

自20世紀(jì)70年代以來，歐洲櫻桃繞實蠅Rhagoletis cerasi一直是在細(xì)胞質(zhì)不親和研究中廣泛采用的野生模式生物。2002年，Riegler＆Stauffer首次報道在櫻桃繞實蠅中發(fā)現(xiàn)了Wolbachia菌;并在同一種實蠅中分離到2株不同的Wolbachia菌株——wCer1和wCer2，其中，歐洲南部和中部的櫻桃繞實蠅存在被這2株菌交叉感染的現(xiàn)象;同時證明了wCer1菌株可以引起宿主生殖發(fā)育中的細(xì)胞質(zhì)不親和。2004年，Riegleret al.成功地將這2株菌人工轉(zhuǎn)移到模式生物擬果蠅Drosophila simulans中，其中，wCer1菌株被成功導(dǎo)入后快速消失，wCer2菌株雖然可以在新的宿主中成功定殖，但引起宿主細(xì)胞質(zhì)不親和的程度較低。2株菌在新的宿主中不能自然維持，證明該種共生菌在不同種生物之間的自然轉(zhuǎn)移可能受到不同因素的限制，除非可以繞過生態(tài)學(xué)障礙。此外，Arthoferet al.在2009年研究了Wolbachia菌在櫻桃繞實蠅中的感染多樣性，指出Wolbachia的地理分布變異性可以影響其種群動力學(xué)，影響對宿主昆蟲的控制，并會對自然入侵和人工誘導(dǎo)的Wolbachia菌株產(chǎn)生障礙。

表1 常見重要經(jīng)濟(jì)實蠅共生細(xì)菌種類Table 1 Symbiotic bacteria of important economic fruit flies

除櫻桃繞實蠅外，在其他實蠅中也發(fā)現(xiàn)過Wolbachia。2002 年，Jamnongluket al.從B.ascita中分離到5株不同的Wolbachia菌。2005年，Rochaet al.在地中海實蠅Ceratltis capitata中首次發(fā)現(xiàn)Wolbachia。2007年，Sunet al.首次證明了我國橘小實蠅B.dorsalis也能被Wolbachia菌感染，該菌可以與宿主實蠅協(xié)同進(jìn)化，既可以在親代和子代之間垂直傳遞，也可以在不同個體間水平傳遞;該菌影響橘小實蠅子代的存活率，但并未證明該菌和橘小實蠅的入侵相關(guān)。繼從按實蠅屬Anaswephasp.的2個種中發(fā)現(xiàn)Wolbachia后，Coscratoet al.(2009)檢測了巴西不同地區(qū)的10種按實蠅樣本，發(fā)現(xiàn)Wolbachia廣泛存在于按實蠅及果蠅中;序列相似性分析表明，果蠅感染的Wolbachia與 Zhouet al.(1998)發(fā)現(xiàn)的wMel為同一菌株，表明該菌在果蠅之間存在大量的橫向轉(zhuǎn)移。

2.1.2 次級共生細(xì)菌 (1)腸桿菌科有益菌。由表1可知，實蠅共生菌大部分屬于腸桿菌科，其中，腸桿菌Enterobacter、檸檬酸桿菌Citrobacter、克雷伯式菌Klebsiella普遍存在于各類宿主實蠅消化道內(nèi)。有關(guān)實蠅消化道共生菌的研究中，使用最多的研究對象是小條實蠅屬的地中海實蠅和果實蠅屬的油橄欖實蠅。

地中海實蠅是一類世界性雜食性入侵害蟲，因其對水果的危害極其嚴(yán)重，而被各國列為植物檢疫的對象(Beharet al.，2008a)。腸桿菌屬和克雷伯式菌屬是在地中海實蠅消化系統(tǒng)中最常分離到的2類共生菌。Marchiniet al.(2002)比較了野生和人工飼養(yǎng)的地中海實蠅種群共生菌的差異，發(fā)現(xiàn)在這2個種群內(nèi)均存在產(chǎn)酸克雷伯式菌和聚團(tuán)腸桿菌;并通過掃描電鏡觀察了2種內(nèi)共生菌的形態(tài)，除1株外，其他分離到的菌株均對存在于實蠅卵表面、由雌蠅生殖腺分泌產(chǎn)生的抗生素敏感。

油橄欖實蠅主要分布于地中海地區(qū)，可為害橄欖，嚴(yán)重時可造成橄欖減產(chǎn)70%(Alberolaet al.，1999)。Sacchettiet al.(2008)研究表明，橄欖樹上的細(xì)菌通過實蠅唇瓣上的擬氣管取食進(jìn)入蟲體，并在食道球中定殖，在消化系統(tǒng)內(nèi)傳遞;E.dacicola除了參與氮固定和果膠降解外，還可為幼蟲提供氨基酸及其他一些橄欖果中缺少的營養(yǎng)元素。Kounatidiset al.(2009)在油橄欖實蠅野生和實驗室種群中均發(fā)現(xiàn)了一種新的共生菌——醋酸桿菌Acetobacter tropicalis，推測該菌可能與實蠅的糖代謝有關(guān)，并通過參與攝入食物的消化過程影響宿主的營養(yǎng)和生理狀況，還可以通過調(diào)節(jié)不同內(nèi)共生物的比例維持腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

許多研究者就腸道內(nèi)共生細(xì)菌對抗生素的敏感性進(jìn)行了研究。如Kuzinaet al.(2001)研究了從墨西哥按實蠅A.ludens中分離到的18株細(xì)菌對抗生素的敏感性。

(2)致病菌。除有益菌以外，實蠅體內(nèi)還存在許多致病菌。如從地中海實蠅體內(nèi)分離到的綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa(Beharet al.，2008b)、從油橄欖實蠅和墨西哥按實蠅體內(nèi)分離到的芽孢桿菌Bacillussp.(Alberolaet al.，1999)，以及從蘋果繞實蠅中分離到的粘質(zhì)沙雷菌Serratia marcescens(Lauzonet al.，2003)等。

2.2 實蠅共生真菌

有關(guān)實蠅共生真菌的研究較少，目前僅報道了2例。Rosaet al.(2006)從按實蠅幼蟲中分離到4株假絲酵母Candida azymoides，經(jīng)鑒定，該假絲酵母是阿斯米假絲酵母C.azym的近緣種。Chakriet al.(2007)從油橄欖實蠅幼蟲的內(nèi)共生微生物群落中分離到1株酵母菌，該酵母菌可以降解橄欖油生產(chǎn)廢水中的多酚類物質(zhì);通過傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)5.8S核糖體基因比對，將該菌株命名為迪丹斯假絲酵母C.diddensiae。該菌株可以幫助油橄欖實蠅幼蟲抵抗取食橄欖時產(chǎn)生的多酚類物質(zhì)，有利于其生存和發(fā)育。

3 實蠅共生菌的生物學(xué)特性

3.1 獨特的遺傳性狀

胞內(nèi)共生菌分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，與宿主聯(lián)系密切，更易與宿主之間進(jìn)行基因交換。由它與宿主系統(tǒng)發(fā)育的一致性推測，最初是由單一細(xì)菌感染宿主的祖先，然后兩者共同進(jìn)化。因此，共生細(xì)菌相對于可單獨存活的細(xì)菌具有獨特的遺傳性狀，如較小的基因組、較高的A+T含量等。這些特征使該菌的進(jìn)化速率加快、遺傳漂變增加(Moran＆Baumann，2000)。

3.2 不可培養(yǎng)性

大部分實蠅共生菌可在宿主體內(nèi)增殖，不可分離培養(yǎng)。Capuzzoet al.(2005)研究表明，體表消毒實蠅的食道球和腸內(nèi)容物接種后僅出現(xiàn)零星的菌落，而未消毒實蠅的食道球和腸內(nèi)容物出現(xiàn)了大量的菌落，證明采用分離培養(yǎng)方法所獲得的細(xì)菌，大部分不是共生菌，而是一些體表寄生菌。當(dāng)然，也存在一些可培養(yǎng)的共生菌。Kounatidiset al.(2009)采用針對醋酸桿菌的特殊培養(yǎng)基，從油橄欖實蠅中分離到1株醋酸桿菌，該菌可以降解并利用培養(yǎng)基中的CaCO3底物。

4 實蠅共生菌對宿主實蠅的作用

初級共生菌可通過引起宿主實蠅細(xì)胞質(zhì)不親和而影響其生殖，該部分研究主要集中在Wolbachia上(Riegler＆Stauffer，2002)。次級共生菌對實蠅的生長發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)性具有重要的作用，主要表現(xiàn)在4個方面。

4.1 參與碳氮循環(huán)

共生菌可為宿主提供食物中缺少的必需氨基酸和礦物質(zhì)。Baerwald＆Boush(1968)從被蘋果繞實蠅R.pomonella幼蟲、蛹、成蟲感染的蘋果組織中檢測到蘋果腐爛假單胞菌Pseudomonas melophthora，研究發(fā)現(xiàn)，該菌可以合成色氨酸，推測該菌可為宿主提供蘋果中缺少的氨基酸(Miyazakiet al.，1968)。Lauzonet al.(1994)從蘋果繞實蠅中分離到聚團(tuán)腸桿菌E.agglomerans、克雷伯式產(chǎn)酸菌K.oxytoca和肺炎桿菌K.pneumoniae，這3種菌均能將不溶性的無毒尿酸降解為可溶性的氨。從聚團(tuán)腸桿菌中分離到的一種具尿酸酶活性、可降解嘌呤的蛋白有利于蘋果實蠅成蟲的存活(Lauzonet al.，2000)。此外，將含酚類物質(zhì)的蘋果葉浸出物和聚團(tuán)腸桿菌一起培養(yǎng)12 h后，蛋白質(zhì)、氨基酸及還原糖含量升高;24 h后，還原糖含量降低，蛋白質(zhì)和氨基酸含量升高(Lauzonet al.，2003)，說明該菌可以為宿主合成氨基酸。Beharet al.(2005)在離體的地中海實蠅腸道內(nèi)及活成蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)固氮還原酶的細(xì)菌;證實了這些細(xì)菌可降解果膠，能通過引起寄主果實的提前成熟保證自己充足的食物(Beharet al.，2008a);并可通過提高雄蟲和雌蟲的交配產(chǎn)卵率(Ben-Yosefet al.，2008b)，最終提高自身對環(huán)境的適應(yīng)能力。共生菌的這些作用具有取食依賴性，當(dāng)實蠅取食比較全面、食物中富含所有其生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)成分時，共生菌的作用并不明顯;只有當(dāng)其取食限制性營養(yǎng)成分的食物時，共生菌才在延長宿主壽命、提高宿生適應(yīng)性方面，表現(xiàn)出很明顯的作用(Ben-Yosefet al.，2008a)。

4.2 引誘實蠅取食產(chǎn)卵

共生菌可產(chǎn)生特殊的揮發(fā)性物質(zhì)，引誘雌性成蟲到特定的寄主內(nèi)產(chǎn)卵。研究表明，不同來源的聚團(tuán)腸桿菌對不同宿主具有不同的引誘能力，且墨西哥按實蠅來源(MFF)菌株比蘋果繞實蠅來源(AMF)菌株產(chǎn)生更多的2，5-二甲基吡嗪，但AMF菌株比 MFF菌株更具引誘性(Robackeret al.，2004)。Robackeret al.(2009)還研究發(fā)現(xiàn)，以尿酸為主要氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌可產(chǎn)生更多的氨和2-壬酮;且上清液中可揮發(fā)物質(zhì)的含量高于菌體懸液，使得上清液和培養(yǎng)液對墨西哥按實蠅的引誘能力高于菌體和空白培養(yǎng)基。另外，從橘小實蠅腸道內(nèi)分離到的共生菌，可以產(chǎn)生揮發(fā)性成分2-丁酮(2-Butanone)及一些胺類物質(zhì)，以引誘橘小實蠅到不同的寄主果實上取食;在缺少食物的情況下，共生菌本身也可被宿主實蠅當(dāng)作食物，保證其正常的生長發(fā)育(Jang ＆ Nishijima，1990)。

4.3 降解食物中的有毒物質(zhì)

研究表明，從蘋果繞實蠅中分離到的聚團(tuán)腸桿菌可以將植物源有毒物質(zhì)根皮苷降解脫毒。蘋果繞實蠅取食不同濃度的無菌根皮苷溶液后，均可在24 h內(nèi)死亡，但聚團(tuán)腸桿菌可在3 d內(nèi)消除低濃度根皮苷溶液對蘋果繞實蠅的毒性(Robacker＆Lauzon，2002)。

4.4 抑制有害菌的生長

Beharet al.(2008b)采用“自殺式”PCR方法，確定了地中海實蠅中除腸桿菌外，還存在一種非優(yōu)勢共生菌——綠膿桿菌。該菌是致病菌，可影響寄主實蠅的發(fā)育，縮短其壽命，但在與腸桿菌同時存在的情況下，其致病能力大大減弱。說明腸桿菌可以阻止致病菌在實蠅體內(nèi)的定殖，提高實蠅的適應(yīng)性。

5 實蠅共生菌研究方法

5.1 共生菌種類的確定

傳統(tǒng)實蠅共生菌的研究方法包括針對可培養(yǎng)菌的分離培養(yǎng)鑒定技術(shù)，以及針對不可培養(yǎng)菌的分子生物學(xué)和顯微成像技術(shù)。(1)分離培養(yǎng)鑒定技術(shù)。通常將實蠅整個蟲體或特定部位組織打碎，制定不同稀釋度的菌懸液(Capuzzoet al.，2005)，涂布特定的選擇培養(yǎng)基平板，獲得不同菌的純培養(yǎng)，然后對該菌進(jìn)行形態(tài)與分子鑒定。(2)分子生物學(xué)技術(shù)。主要包括共生菌16S rRNA基因文庫的構(gòu)建(Kounatidiset al.，2009)及變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)。PCR-DGGE技術(shù)需要先提取實蠅體內(nèi)的宏基因組，通用引物擴(kuò)增共生菌16S rRNA基因片段，然后采用DGGE電泳技術(shù)將不同序列的基因片段分開并測序，通過序列分析確定內(nèi)共生菌的種類。(3)顯微成像技術(shù)。通過掃描電鏡、透射電鏡、激光共聚焦顯微鏡等儀器，直接觀察分布于蟲體不同位置的共生菌。3種方法的優(yōu)缺點見表2。

表2 共生菌研究方法的比較Table 2 Comparison among three research methods of symbiont

在實際應(yīng)用中，應(yīng)有針對性地選擇研究方法。筆者認(rèn)為，若要系統(tǒng)地研究某類實蠅共生菌的多樣性，應(yīng)采用16S rRNA基因文庫構(gòu)建的方法，以免造成對一些不可培養(yǎng)共生菌的忽略;若要研究共生菌對宿主的功能，則應(yīng)采取分離培養(yǎng)技術(shù)，獲得目的菌的純培養(yǎng)后進(jìn)行功能驗證;若要研究共生菌在實蠅體內(nèi)的定位，則應(yīng)選取顯微成像技術(shù);而在實蠅初級共生菌與宿主協(xié)同進(jìn)化關(guān)系的研究中，多采取分子生物學(xué)技術(shù)獲得共生菌的相關(guān)目的基因。

3種研究方法并不是孤立的，在具體研究中往往被結(jié)合使用。如Kounatidiset al.在2009年的研究中，首先通過建立16S rRNA基因文庫的方法，確定油橄欖實蠅含有3種共生菌，并計算出每種菌所占的比例;然后通過透射電鏡技術(shù)，觀察到該實蠅的1種共生菌，并將其確定為醋酸桿菌;最后對醋酸桿菌進(jìn)行了選擇性的分離培養(yǎng)，研究了其理化性質(zhì)，并推測了其對宿主的作用。

5.2 共生菌與宿主共生關(guān)系的確定

共生菌研究的關(guān)鍵是其與宿主實蠅共生關(guān)系的確定。對于不可培養(yǎng)菌，一般采用分子生物學(xué)技術(shù)，通過檢測同代實蠅不同蟲態(tài)及不同世代個體中特定基因的表達(dá)，確定其共生關(guān)系;對于可培養(yǎng)細(xì)菌，則可將分離到的菌重新接種到宿主實蠅體內(nèi)，通過觀察該菌在宿主體內(nèi)定殖、分布以及在不同世代間的傳遞，確定其共生關(guān)系。

Lauzonet al.(2009)選取地中海實蠅及在其體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的聚團(tuán)腸桿菌和肺炎桿菌為研究對象，分別將EGFP和DsRed等2種熒光蛋白基因?qū)脒@2種細(xì)菌中，然后使用轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌給實蠅喂食，通過熒光顯微鏡和掃描電鏡觀察，確定了2種菌在實蠅體內(nèi)的數(shù)量、定殖及分布位置。同樣的方法也被用于觀察這2種細(xì)菌在核桃繞實蠅R.juglandis腸內(nèi)的分布與定殖情況(Peloquinet al.，2002)。

5.3 共生菌在宿主體內(nèi)的定位

研究共生菌在宿主體內(nèi)的定位，有利于推測其對宿主的作用。研究方法分為3種。(1)選取宿主實蠅特定部位分別進(jìn)行共生菌篩查，可明確共生菌在宿主每個器官的分布情況。(2)熒光標(biāo)記技術(shù)。將熒光蛋白基因?qū)牍采?，再將共生菌?dǎo)入宿主，通過檢測熒光信號所處位置定位共生菌。Kounatidiset al.(2009)在分離到醋酸桿菌之后，將GFP和DsRed等2種基因分別導(dǎo)入該醋酸桿菌和大腸桿菌DH-5α，然后通過喂食將其導(dǎo)入油橄欖實蠅。發(fā)現(xiàn)醋酸桿菌可在寄主體內(nèi)定殖，而大腸桿菌無法定殖，這在一定程度上證明了醋酸桿菌和油橄欖實蠅的共生關(guān)系。(3)熒光原位雜交技術(shù)。該技術(shù)建立在獲得共生菌部分基因序列的基礎(chǔ)上，通過獲得的基因序列設(shè)計寡核苷酸探針，采用熒光染料標(biāo)記探針，探針和共生菌的互補(bǔ)核酸序列在細(xì)胞內(nèi)完整地結(jié)合，通過熒光信號，直觀地檢測到共生菌在宿主體內(nèi)的分布情況(Tanget al.，2010)。

6 研究中有待解決的問題

6.1 試驗材料的選擇

由于實蠅是重要的農(nóng)業(yè)害蟲，人工飼養(yǎng)需要在國家檢疫部門特批的單位進(jìn)行，并嚴(yán)格對其進(jìn)行隔離，這給實蠅生物學(xué)試驗的開展造成了不便。此外，利用實蠅實驗室種群進(jìn)行生物學(xué)試驗，無法完全模擬其在自然環(huán)境中的各種行為和生理生態(tài)特征，因此，共生菌對實蠅實驗室種群的作用也無法等同于其在自然條件下對宿主的作用。只有在自然環(huán)境下，以實蠅野生種群為研究對象，才能真正明確共生菌對宿主實蠅的作用。但由于實蠅具有很高的環(huán)境適應(yīng)性和遷飛能力，一旦建立種群，會對當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成很大影響，這使得以實蠅野生種群為研究對象變得困難，進(jìn)一步阻礙了實蠅共生菌功能的研究。

6.2 共生菌分離技術(shù)

傳統(tǒng)的分離技術(shù)主要包括組織懸液涂布平板培養(yǎng)、顯微鏡下挑取單菌落培養(yǎng)、梯度離心法等(陳法軍等，2005)。但對于大部分不可培養(yǎng)菌，只能通過提取DNA，擴(kuò)增其16S rRNA基因來獲得部分遺傳信息，進(jìn)而確定其種類，無法在實驗室條件下進(jìn)行功能的研究。而共生關(guān)系研究的理想模式是:參與共生的生物能夠保存，并能在分離的條件下分別進(jìn)行研究;共生系統(tǒng)可以由組成它的生物重新組合(張玨鋒等，2006)。因此，只有在解決共生菌分離純化的前提下，才能更好地研究其功能，并對其改造。

6.3 非優(yōu)勢菌的檢測

在已知的實蠅共生菌中，腸桿菌是絕對優(yōu)勢種群，一些非優(yōu)勢種群常常被忽視，而這些非優(yōu)勢種群有可能對宿主有更重要的影響。雖然已有研究提出用“自殺式”PCR擴(kuò)增實蠅體內(nèi)的非優(yōu)勢種群(Beharet al.，2008b)，但目前還沒有更好的辦法消除優(yōu)勢腸道共生菌的影響。

7 展望

實蠅分布極其廣泛，屬于入侵性害蟲，到達(dá)新的入侵地后，能夠迅速占領(lǐng)生態(tài)位，形成種群，嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)業(yè)生產(chǎn)。研究實蠅的種群遺傳、入侵途徑、入侵機(jī)制及擴(kuò)散蔓延規(guī)律，對于及早制定檢疫措施、降低實蠅危害水平等具有重要意義。在現(xiàn)有的實蠅防治方法中，不育技術(shù)具有廣闊的發(fā)展前景，但不育雄蟲較低的生產(chǎn)力和較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性阻礙了該類技術(shù)的推廣應(yīng)用。

筆者認(rèn)為，以下問題將成為實蠅共生菌的研究熱點。首先是共生菌與實蠅入侵之間的關(guān)系，包括明確共生菌對實蠅種群遺傳的影響及其機(jī)制;其次是共生菌生物學(xué)和遺傳特征、共生菌基因組的改造、將改造的共生菌導(dǎo)入宿主的方法、不同種宿主實蠅共生菌的差異、不同地理種群宿主實蠅共生菌的差異、不同種類共生菌對實蠅的引誘能力，以及新型實蠅生防制劑的開發(fā)等。這些問題的研究對提高不育雄蟲的生活能力、不育技術(shù)推廣等具有重要意義。

此外，現(xiàn)階段已發(fā)現(xiàn)的實蠅共生菌多是次級共生菌，初級共生菌僅有Wolbachia。在其他昆蟲共生菌的研究中，發(fā)現(xiàn)次級共生菌會在進(jìn)化過程中向初級共生菌轉(zhuǎn)變。如在蚜蟲中就存在初級共生菌布克納什菌被次級共生菌“Ca.Serratia symbiotica”取代的現(xiàn)象，且該菌具備為宿主合成必需氨基酸的功能，同時能與宿主協(xié)同進(jìn)化(Burkeet al.，2009)。在實蠅中是否也存在這種現(xiàn)象，這種現(xiàn)象與實蠅的種群分化具有怎樣的聯(lián)系，對其生物入侵又具有怎樣的作用等，都有待進(jìn)一步研究。

陳法軍，張玨鋒，俞曉平.2005.稻飛虱酵母類胞內(nèi)共生菌的組織學(xué)研究進(jìn)展.昆蟲知識，42(6):607－611.

陳乃中.2009.中國進(jìn)境植物檢疫性有害生物——昆蟲卷.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社.

馮利，孫玉誠，戈峰，馬駿.2008.蚜蟲—內(nèi)共生菌的互利共生研究綜述.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，20(6):65－68.

龔鵬，沈佐銳，李志紅.2002.Wolbachia屬共生細(xì)菌及其對節(jié)肢動物生殖活動的調(diào)控作用.昆蟲學(xué)報，45(2):241－252.

施婉君，程家安，祝增榮.2002.昆蟲共生細(xì)菌Wolbachia的研究進(jìn)展.生態(tài)學(xué)報，22(3):409－419.

譚周進(jìn)，肖啟明，謝丙炎，楊宇紅，馮蘭香.2005.昆蟲內(nèi)共生菌研究概況.微生物學(xué)通報，32(4):140－143.

吳佳教.2009.實蠅類重要害蟲鑒定圖冊.廣州:廣東科技出版社.

薛寶燕，程新勝，陳樹仁，魏重生.2004.昆蟲共生菌研究進(jìn)展.中國微生態(tài)學(xué)雜志，16(3):189－191.

張玨鋒，呂仲賢，陳法軍，陳建明，鄭許松，徐紅星，陳列忠，俞曉平.2006.褐飛虱不同致害性種群體內(nèi)共生菌18S rDNA部分序列比較.昆蟲學(xué)報，49(3):528－532.

Aksoy S，Chen X and Hypsa V.1997.Phylogeny and potential transmission routes of midgut-associated endosymbionts of tsetse(Diptera:Glossinidae).Insect Molecular Biology，6:183－190.

Alberola T M，Aptosoglou S，Arsenakis M，Bel Y，Delrio G，Ellar D J，F(xiàn)erré J，Granero F，Guttmann D M and Koliais S.1999.Insecticidal activity of strains ofBacillus thuringiensison larvae and adults ofBactrocera oleaeGmelin(Dipt.Tephritidae).Journal of Invertebrate Pathology，74:127 －136.

Arthofer W，Riegler M，Schneider D，Krammer M，Miller W J and Stauffer C.2009.HiddenWolbachiadiversity in field populations of the European cherry fruit fly，Rhagoletis cerasi(Diptera，Tephritidae).Molecular Ecology，18:3816 －3830.

Baerwald R J and Boush G M.1968.Demonstration of the bacterial symbiotePseudomonas melophthorain the apple maggotRhagoletis pomonella， by fluorescent-antibody technique.Journal of Invertebrate Pathology，11:251 －259.

Baumann P，Baumann L，Lai C Y，Rouhbakhsh D，Moran N A and Clark M A.1995.Genetics，physiology，and revolutionary relationship of the genusBuchnera intracellularsymbionts of aphids.Annual Review of Microbiology，49:55 －94.

Behar A，Yuval B and Jurkevitch E.2005.Enterobacteria-mediated nitrogen fixation in natural populations of the fruit flyCeratitis capitata.Molecular Ecology，14:2637 －2643.

Behar A，Yuval B and Jurkevitch E.2008a.Community structure of the Mediterranean fruit fly microbiota:seasonal and spatial sources of variation.Israel Journal of Ecology and E-volution，54:181 －191.

Behar A，Yuval B and Jurkevitch E.2008b.Gut bacterial communities in the Mediterranean fruit fly(Ceratitis capitata)and their impact on host longevity.Journal of Insect Physiology，54:1377 －1383.

Behar A，Jurkevitch E and Yuval B.2008c.Bringing back the fruit into fruit fly-bacteria interactions.Molecular Ecology，17:1375－1386.

Belcari A，Saccheti P，Marchi G and Surico G.2003.La mosca delle olive e la simbiosi batterica.Informatore Fitopatologico，53(9):55 －59.

Ben-Yosef M，Behar A，Jurkevitch E and Yuval B.2008a.Bacteria-diet interactions affect longevity in the medfly-Ceratitis capitata.Journal of Applied Entomology，132:690 －694.

Ben-Yosef M，Jurkevitch E and Yuval B.2008b.Effect of bacteria on nutritional status and reproductive success of the Mediterranean fruit flyCeratitis capitata.Physiological Entomology，33:145 －154.

Bextine B，Lauzon C，Potter S，Lampe D and Miller T A.2005.Establishment of a genetically marked insect-derived symbiont in multiple host plants.Current Microbiology，50:1 －7.

Buchner P.1965.Endosymbiosis of Animals with Plant Microorganisms.New York:Interscience Publishers.

Burke G R，Normark B B，F(xiàn)avret C and Moran N A.2009.E-volution and diversity of facultative symbionts from the aphid subfamily Lachninae.Applied and Environmental Microbiology，75:5328 －5335.

Capuzzo C，F(xiàn)irrao G，Mazzon L，Squartini A and Girolami V.2005.‘CandidatusErwinia dacicola’，a coevolved symbiotic bacterium of the olive flyBactrocera oleae(Gmelin).International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，55:1641 －1647.

Chakri M，El-Haidani A，El-Mzibri M，Haggoud A，Iraqui M，Houari A and Koraichi S I.2007.Yeast strains from the endogenous microflora of the olive fliesBactrocera oleaelarvae which could degrade the olive oil mill wastewaters polyphenols.Annals of Microbiology，57:143 － 147.

Chiel E，Inbar M，Mozes-Daube N，White J A，Hunter M S and Zchori-Fein E.2009.Assessments of fitness effects by the facultative symbiontRickettsiain the sweetpotato whitefly(Hemiptera:Aleyrodidae).Annals of the Entomological Society of America，102:413 －418.

Coscrato V E，Braz A S K，Perondini A L，Selivon D and Marino C L.2009.Wolbachiain anastrepha fruit flies(Diptera:Tephritidae) .Current Microbiology，59:295 －301.

Donovan S E，Purdy K J，Kane M D and Eggleton P.2004.Comparison ofEuryarchaeastrains in the guts and food-soil of the soil-feeding termiteCubitermes fungifaberacross different soil types.Applied and Environmental Microbiology，70:3884－3892.

Estes A M，Hearn D J，Bronstein J L and Pierson E A.2009.The olive fly endosymbiont，“CandidatusErwinia dacicola”，switches from an intracellular existence to an extracellular existence during host insect development.Applied and Environmental Microbiology，75:7097 －7106.

Girolami V.1983.Fruit fly symbiosis and adult survival:general aspects∥Rotterdam R C.Fruit Flies of Economic Importance.Athens:Proc CEC/IOBC Int Symp，74－76.

Jamnongluk W，Kittayapong P，Baimai V and O'Neill S L.2002.Wolbachiainfections of tephritid fruit flies:molecular evidence for five distinct strains in a single host species.Current Microbiology，45:255 －260.

Jang E B and Nishijima K A.1990.Identification and attractancy of bacteria associated withDacus dorsalis(Diptera:Tephritidae) .Environmental Entomology，19:1726 －1731.

Konstantopoulou M A，Raptopoulos D G，Stavrakis N G and Mazomenos B E.2005.Microflora species and their volatile compounds affecting development of an alcohol dehydrogenase homozygous strain(Adh-I)ofBactrocera(Dacus)oleae(Diptera:Tephritidae) .Journal of Economic Entomology，98:1943－1949.

Kounatidis I，Crotti E，Sapountzis P，Sacchi L，Rizzi A，Chouaia B，Bandi C，Alma A，Daffonchio D，Mavragani-Tsipidou P and Bourtzis K.2009.Acetobacter tropicalisis a major symbiont of the olive fruit fly(Bactrocera oleae).Applied and Environmental Microbiology，75:3281 －3288.

Kuzina L V，Peloquin J J，Vacek D C and Miller T A.2001.Isolation and identification of bacteria associated with adult laboratory Mexican fruit flies，Anastrepha ludens(Diptera:Tephritidae).Current Microbiology，42:290 －294.

Lauzon C R，Sjogren R E and Maccollom G B.1994.Characteristics of bacteria isolated from two tephritid species，Rhagoletis pomonellaandCeratitis capitata.Proceedings，F(xiàn)ourth Interna-tional Fruit Fly Symposium.Sand Key，F(xiàn)lorida.

Lauzon C R，Sjogren R E and Prokopy R J.2000.Enzymatic capabilities of bacteria associated with apple maggot flies:a postulated role in attraction.Journal of Chemical Ecology，26:953－967.

Lauzon C R，Bussert T G，Sjogren R E and Prokopy R J.2003.Serratia marcescensas a bacterial pathogen ofRhagoletis pomonellaflies(Diptera:Tephritidae).European Journal of Entomology，100:87 －92.

Lauzon C R，McCombs S D，Potter S E and Peabody N C.2009.Establishment and vertical passage ofEnterobacter(Pantoea)agglomeransandKlebsiella pneumoniaethrough all life stages of the Mediterranean fruit fly(Diptera:Tephritidae).Annals of the Entomological Society of America，102:85－95.

Marchini D，Rosetto M，Dallai R and Marri L.2002.Bacteria associated with the oesophageal bulb of the medflyCeratitis capitata(Diptera:Tephritidae).Current Microbiology，44:120－124.

Miyazaki S，Bousch G M and Baerwald R J.1968.Amino acid synthesis byPseudomonas melophthora，bacterial symbiote ofRhagoletis pomonella(Diptera).Journal of Insect Physiology，14:513 －518.

Moran N A and Baumann P.2000.Bacterial endosymbionts in animals.Current Opinion in Microbiology，3:270 －275.

Peloquin J J，Kuzina L，Lauzon C R and Miller T A.2000.Transformation of internal extracellular bacteria isolated fromRhagoletis completaCresson gut with enhanced green fluorescent protein.Current Microbiology，40:367 －371.

Peloquin J J，Lauzon C R，Potter S and Miller T A.2002.Transformed bacterial symbionts re-introduced to and detected in host gut.Current Microbiology，45:41 － 45.

Petri L.1909.Ricerche Sopra i Batteri Intestinali della Mosca Olearia.Roma:Memorie della Regia Stazione di Patologia Vegetale di Roma(in Italian).

Prabhakar C S，Sood P，Kapoor V，Kanwar S S，Mehta P K and Sharma P N.2009.Molecular and biochemical characterization of three bacterial symbionts of fruit fly，Bactrocera tau(Tephritidae:Diptera).Journal of General and Applied Microbiology，55:479 －487.

Riegler M and Stauffer C.2002.Wolbachiainfections and superinfections in cytoplasmically incompatible populations of the European cherry fruit flyRhagoletis cerasi(Diptera，Tephritidae).Molecular Ecology，11:2425 －2434.

Riegler M，Charlat S，Stauffer C and Mercot H.2004.Wolbachiatransfer fromRhagoletis cerasitoDrosophila simulans:investigating the outcomes of host-symbiont coevolution.Applied and Environmental Microbiology，70:273 －279.

Robacker D C and Lauzon C R.2002.Purine metabolizing capability of(Enterobacter agglomerans)affects volatiles production and attractiveness to Mexican fruit fly.Journal of Chemical Ecology，28:1549 －1563.

Robacker D C，Lauzon C R and He X.2004.Volatiles production and attractiveness to the Mexican fruit fly ofEnterobacter agglomeransisolated from apple maggot and Mexican fruit flies.Journal of Chemical Ecology，30:1329 －1347.

Robacker D C，Lauzon C R，Patt J，Margara F and Sacchetti P.2009.Attraction of Mexican fruit flies(Diptera:Tephritidae)to bacteria:effects of culturing medium on odour volatiles.Journal of Applied Entomology，133:155 －163.

Rocha L S，Mascarenhas R O，Perondini A L P and Selivon D.2005.Occurrence ofWolbachiain Brazilian samples ofCeratitis capitata(Wiedemann)(Diptera:Tephritidae).Neotropical Entomology，34:1013 －1015.

Rosa C A，Morais P B，Lachanee M A，Pimenta R S，Santos R O，Trindade R C，F(xiàn)igueroa D L，Resende M A and Braganca M A L.2006.Candida azymoidessp.nov.，a yeast species from tropical fruits and larva(Ascomycota)ofAnastrepha mucronota(Diptera:Tephritidae).Lundiana，7(2):83 －86.

Sacchetti P，Granchietti A，Landini S，Viti C，Giovannetti L and Belcari A.2008.Relationships between the olive fly and bacteria.Journal of Applied Entomology，132:682 －689.

Schabereiter-Gurtner C，Lubitz W and Rolleke S.2003.Application of broad-range 16S rRNA PCR amplification and DGGE fingerprinting for detection of tick-infecting bacteria.Journal of Microbiological Methods，52:251 －260.

Skaljac M，Zanic K，Ban S G，Kontsedalov S and Ghanim M.2010.Co-infection and localization of secondary symbionts in two whitefly species.BMC Microbiology，10:142.

Sood P and Nath A.2002.Bacteria associated withBactrocerasp.(Diptera:Tephritidae)—isolation and identification.Pest Management and Economic Zoology，10:1 －9.

Stamopoulos D C and Tzanetakis N M.1988.Bacterial flora isolated from the oesophageal bulb of the olive fruit flyDacus oleae(Gmelin).Entomologia Hellenica，6(6):43 －48.

Sun X，Cui L and Li Z.2007.Diversity and phylogeny ofWolbachiainfectingBactrocera dorsalis(Diptera:Tephritidae)populations from China.Environment Entomology，36:1283 －1289.

Tang M，Lv L，Jing S L，Zhu L L and He G C.2010.Bacterial symbionts of the brown planthopperNilaparvata lugens(Homoptera:Delphacidae).Applied and Environmental Microbiology，76:1740 －1745.

Tsiropoulos G I.1983.Microflora associated with wild and laboratory reared olive fruit fliesDacus oleae(Gmel.).Zeitschrift für Angewandte Entomologie，96:337 －340.

Zchori-Fein E and Brown J K.2002.Diversity of prokaryotes associated withBemisia tabaci(Gennadius)(Hemiptera:Aleyrodidae).Annals of the Entomological Society of America，95:711 －718.

Zhou W，Rousset F and O'Neil S L.1998.Phylogeny and PCR-based classification ofWolbachiastrain using wsp gene sequences.Proceedings of the Royal Society of London Series B，265:509 －515.