去甲斑蝥素誘導人鼻咽癌細胞CNE1凋亡的實驗研究﹡

孫 健 王 炎 王國娟 李 琦

上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院 （上海中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合腫瘤介入研究所），上海200062

中國是鼻咽癌（nasopharynegeal carcinoma，NPC）高發(fā)區(qū)，發(fā)病率占全世界80%以上[1]。目前，鼻咽癌的治療以放射治療為主，但5年生存率僅50%左右，因此，尋找有效的治療手段和藥物是鼻咽癌研究的熱點[2]。去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）是由我國首先合成的一種抗腫瘤藥物，是一種中藥單體，目前已應用在多種腫瘤的實驗和臨床治療研究[3]。目前，有關(guān)NCTD治療鼻咽癌的研究尚未見報道。筆者研究了NCTD對鼻咽癌細胞CNE1增殖和凋亡的影響，為NCTD臨床治療鼻咽癌提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

去甲斑蝥素（山東平原制藥廠，H37023401）。RPMI 1640培養(yǎng)液（GIBCO公司）；人鼻咽癌細胞株（CNE1）（中科院上海細胞庫），37℃恒溫，5% CO2密閉傳代培養(yǎng)；PI染料（Sigma公司）；凋亡檢測試劑盒（BD公司）。

1.2 方法

NCTD溶解于1640培養(yǎng)液，過濾后除菌，配制成100 mmol/L NCTD母液。用10%小牛血清的1640培養(yǎng)液將NCTD母液稀釋成 10、20、40、60、80、100μmol/L 的工作液。

1.2.1 MTT比色法檢測CNE1細胞的增殖 胰蛋白酶消化CNE1細胞并計數(shù)后，按每孔1×104個細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)。24 h后，隨機分為 7組，分別加入含0、10、20、40、60、80、100μmol/L的 NCTD 培養(yǎng)液，以 0μmol/L的 NCTD 為對照組。按NCTD的作用時間，24、48、72 h分別進行MTT檢測。稱取0.005 g MTT干粉，加入10 mL無抗生素的1640培養(yǎng)液中，過濾除菌，配成MTT工作液。96孔細胞培養(yǎng)板每孔加入100μL MTT工作液，培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔加入150μL DMSO，振蕩器加速結(jié)晶紫溶解，570 nm酶標儀測定吸光度值，所有孔吸光度值都減去空白孔吸光度值處理。細胞增殖抑制率=（對照孔-實驗孔）/對照孔×100%，根據(jù)抑制率作出NCTD作用曲線并計算半數(shù)抑制濃度IC50值。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡及細胞周期 胰蛋白酶消化CNE1細胞并計數(shù)后，按每孔1×105個細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)。實驗分為4組，分別加入0、10、20、40μmol/L濃度的NCTD，每組設(shè)3個復孔。48 h后，消化并搜集細胞，PBS清洗2次。凋亡采用BD公司Annexin V ：FITC Apoptosis Detection Kit I試劑盒，處理方法參考相關(guān)說明書。采用FACScaliub流式細胞儀對樣品進行檢測， 每次計細胞數(shù)20 000個，分析軟件Cell Quest計算凋亡率。檢測細胞周期需在PBS液清洗兩次后加入200μL固定液（2%小牛血清，70%乙醇，28%PBS）4℃固定1 h，PBS清洗2次，加入PI（終濃度50μg/mL）和無DNA酶污染的RNA酶（終濃度50μg/mL）500μL染色1 h，流式細胞儀檢測DNA含量，ModFIT LT 2.0軟件分析細胞周期。

1.3 統(tǒng)計學處理

所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS11.0進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)均以（± s）表示。各組實驗數(shù)據(jù)間進行方差分析，P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CNE1細胞的生長增殖情況

NCTD作用CNE1細胞48 h后，細胞生長受到抑制，這一抑制作用隨NCTD濃度的升高而升高。圖1為NCTD作用48 h后CNE細胞的生長情況。隨著NCTD濃度升高，CNE1細胞數(shù)明顯減少，并呈現(xiàn)皺縮、凋亡。

圖1 NCTD作用48 h后CNE1細胞生長情況

2.2 MTT檢測CNE1細胞增殖

不同濃度的NCTD作用細胞后，細胞生長受到不同程度的抑制，這一抑制作用隨NCTD濃度的變化而變化，組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），并且濃度和時間與抑制率間呈現(xiàn)明顯的依賴效應（表1），NCTD對CNE細胞的IC50值24、48、72 h 分別為 86.5、40.8、28.2μmol/L。

表1 不同濃度NCTD作用于CNE細胞不同時間的抑制率（x ± s，%）

2.3 細胞凋亡的檢測

不同濃度的NCTD作用細胞后，細胞生長受到不同程度的抑制并出現(xiàn)凋亡，凋亡率隨著NCTD濃度的變化而變化，各加藥組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 48 h不同濃度NCTD作用組 CNE細胞的凋亡比例（x ± s，%）

2.4 細胞周期分析

不同濃度的NCTD作用細胞后，細胞生長周期發(fā)生改變，G2期細胞明顯增多，G2期細胞比例隨著NCTD濃度的變化而變化，各加藥組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。見表3。

表3 48 h不同濃度NCTD作用 CNE細胞后各期細胞比例變化（ ± s，%）

表3 48 h不同濃度NCTD作用 CNE細胞后各期細胞比例變化（ ± s，%）

NCTD濃度（μmol/L） G0/G1期 P S期 G2期 P 0 63.7±2.19 - 30.29±0.88 5.38±1.06 -10 68.55±1.26 ＜0.01 12.61±1.12 18.63±1.45 ＜0.01 20 66.15±1.43 ＜0.01 13.55±0.64 20.52±1.38 ＜0.01 40 56.56±2.22 ＜0.01 2.05±1.68 42.59±3.19 ＜0.01

3 討論

細胞凋亡是細胞的一種主動、程序化生理過程，它的發(fā)生受到環(huán)境刺激、生理和病理等因素的調(diào)控。該過程的正?；蛭蓙y與機體進行新陳代謝、保持自身相對穩(wěn)定以及腫瘤發(fā)生等密切相關(guān)[4]。目前，很多藥物和治療手段都與誘導腫瘤細胞凋亡有關(guān)。NCTD是由我國上世紀80年代在研究斑蟊素的基礎(chǔ)上首先合成的一種抗腫瘤藥物，它可以抑制腫瘤細胞的DNA及蛋白質(zhì)合成，誘導其凋亡。目前，NCTD主要用于消化系統(tǒng)腫瘤，尤其是肝癌的治療。由于其副作用小，無腎毒性和骨髓毒性，是一種具有很大潛在應用價值的抗癌藥物[5-8]。本研究結(jié)果顯示，NCTD對體外培養(yǎng)的CNE1細胞的生長有明顯的抑制作用，能夠誘導CNE1細胞凋亡，阻滯細胞周期于G2期，抑制細胞分裂，且呈時間和劑量依賴性。

由于鼻咽癌惡性程度較高，早期即可出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而且由于放化療等治療手段對患者身體有極大的損害，導致鼻咽癌患者的5年生存率較低[2]。近年來，中藥復方和中藥單體治療鼻咽癌的優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)出來[9-10]。中藥在改善癥狀、提高生活質(zhì)量、延長生存期等方面具有優(yōu)勢[11]。NCTD作為一種中藥單體，對鼻咽癌細胞的生長有明顯抑制作用和凋亡誘導作用，在其他腫瘤臨床上的運用預示著NCTD作為抗腫瘤藥物用于治療鼻咽癌的潛在價值。

[1] 黃騰波.鼻咽癌高危人群，癌前病變與癌的早期檢出[J].中國腫瘤，1996，5（5）：9.

[2] 謝冰芬，郝東磊，劉宗潮，等.茶多酚對鼻咽癌CNE2 細胞DNA損傷和細胞周期的影響[J].中國藥理學通報，1999，14（15）：424-427.

[3] 李先茜，邵世和，傅桂蓮，等.去甲斑蝥素誘導人肝癌細胞凋亡的研究[J].山東醫(yī)藥，2010，50（25）：9-11.

[4] Kerr JF,Wyllie AH,Currie AR. Apoptosis： a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics[J].Br J Cancer,1972,26:239-257.

[5] Sun ZX,Ma QW,Zhao TD,et al.Apoptosis induced by norcantharidin in human tumor cells[J].World J Gastroenterol,2000,6（2）:263-265.

[6] Liu XH,Blazsek I,Comisso M,et al. Effects of norcantharidin，a protein phosphatase type-2A inhibitor， on the growth of normal and malignant haemopoietic cells[J].EJC,1995,31A（6）:953-963.

[7] 周利紅，李琦，范忠澤，等.去甲斑蝥素控釋微球的肝動脈栓塞作用和急性毒性實驗 [J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20（5）：1045-1048.

[8] 黃雪強，凌昌全，宋田斌，等.去甲斑蝥素誘導人T淋巴細胞白血病細胞株凋亡的實驗研究[J].浙江中醫(yī)學院學報，2001，25（5）：49-52.

[9] 潘運寶，夏洪平，楊惠玲，等.復方小柴胡湯調(diào)控microRNA抑制鼻咽癌細胞增殖[J].分子診斷與治療雜志，2010， 2（5）：323-327.

[10] 袁淑蘭，王艷萍，陳曉禾，等.丹參酮IIA誘導人鼻咽癌細胞凋亡及其作用機制的體外實驗研究[J].華西醫(yī)大學報，2002，33（1）：84-86.

[11] 肖穎，李覃.中醫(yī)藥抗腫瘤作用機制的研究進展[J].中國醫(yī)學雜志，2008，6（3）：38-40.