液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定水中的微囊藻毒素

楊 帆，錢(qián) 寧，戴 欣，彭 俊

（松遼流域水資源保護(hù)局，吉林 長(zhǎng)春130021）

近年來(lái)環(huán)境污染和富營(yíng)養(yǎng)化程度不斷加劇，藍(lán)藻水華頻繁發(fā)生，這已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外普遍關(guān)注的問(wèn)題。微囊藻毒素即為水體中藍(lán)藻類如銅綠微囊藻、魚(yú)腥藻和念珠藻等藻屬水華釋放一類具有強(qiáng)烈致癌、具有肝毒性的單環(huán)七肽化合物，它的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)可表示為：環(huán)D-丙氨酸-L-X-赤-β-甲基-D-異天冬氨酸-L-Y-Adda-D-異谷氨酸-N-甲基脫氫丙氨酸。其中Adda是表達(dá)MC活性的必需基因，其結(jié)構(gòu)改變或被去除，毒素的毒性都會(huì)降低。X，Y為2個(gè)可變的L-氨基酸。由于X，Y的不同而產(chǎn)生多種異構(gòu)體，目前已知有60多種。其中存在最普遍、含量較多、毒性較大的是MCLR，MC-RR和MC-YR(L，R，Y分別代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Agilent 1200 series-Agilent 6310 Ion Trap MS液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀；Caliper Life Scienes全自動(dòng)固相萃取裝置；ISOLUTE C18（EC）固相萃取柱（200 mg，3 mL）；OA-SYSTM 氮吹裝置；電子天平（0.0001 g）；KD-濃縮瓶；濾膜（0.45 μm GF/C玻璃纖維濾膜）；過(guò)濾頭。甲醇、甲酸均為Burdick&Jackson色譜純；水為wahaha純凈水；微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品10 mg/L。

1.2 樣品前處理

1.2.1 樣品制備

用0.45 μm GF/C玻璃纖維濾膜過(guò)濾水樣，用少量甲醇清洗濾膜。

1.2.2 樣品的富集和洗脫

設(shè)置10 ml甲醇和10 ml高純水，用流速為1 ml/min活化固相萃取柱。取1000 ml水樣濾液（1.2.1）以及空白和加標(biāo)樣品，以10 ml/min的流速通過(guò)全自動(dòng)固相萃取裝置進(jìn)行富集。當(dāng)所有樣品通過(guò)萃取柱后，用高純氮?dú)獯? min，再用10 ml20%甲醇淋洗液淋洗固相萃取柱。最后用10 ml100%甲醇洗脫富集在柱上的微囊藻毒素，將洗脫液收集在KD-濃縮瓶?jī)?nèi)。

1.2.3 富集濃縮

將KD-濃縮瓶放在40℃的水浴上，用氮?dú)獯得摑饪s至0.5 ml，用甲醇定容至1 ml，經(jīng)過(guò)濾頭轉(zhuǎn)移至樣品瓶。

1.3 色譜條件

Agilent 1200 Series液相色譜，色譜柱ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）,柱溫20℃，流動(dòng)相為甲醇和0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液，流速為0.3 ml/min，梯度洗脫為5.0 min內(nèi)甲醇的體積分?jǐn)?shù)從40%升至100%，保持12 min；進(jìn)樣量為10 ul。

1.4 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜工作條件見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)條件優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相選擇

相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)方法以及文獻(xiàn)中對(duì)于水中微囊藻毒素(MC-LR)的分析多為液相色譜法，使用乙腈和磷酸鹽作為流動(dòng)相，通過(guò)紫外檢測(cè)器檢測(cè)，乙腈毒性大、成本高，而且磷酸鹽容易堵塞色譜柱，影響離子化效率，污染離子源。這里選擇甲醇和水作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，并且考慮到酸性環(huán)境可以保證MC-LR的離子化效率，故在水中加入0.1%甲酸，這樣可以降低分析成本，保護(hù)色譜柱和離子源，并且減少了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)操作人員的危害。

表1 質(zhì)譜工作條件表

2.1.2 離子模式選擇

其它條件相同時(shí)，改變離子模式采集總離子流圖，比較正負(fù)模式提取離子流圖（EIC），正模式的響應(yīng)值明顯高于負(fù)模式，所以選擇正模式。見(jiàn)圖1。

圖1 正模式和負(fù)模式提取離子比較圖

2.1.3 其它質(zhì)譜條件選擇

毛細(xì)管出口電壓和錐孔電壓影響離子的傳輸效率和離子阱的捕集效率，控制這兩個(gè)電壓可以方便地控制碰撞能量，從而得到不同豐度的碎片離子。當(dāng)毛細(xì)管出口電壓和錐孔電壓過(guò)大時(shí)，傳輸效率高，但是會(huì)在傳輸過(guò)程中發(fā)生傳輸區(qū)的碰撞誘導(dǎo)解離，這里發(fā)生的碰撞誘導(dǎo)解離會(huì)使母離子破碎；過(guò)小會(huì)減低母離子傳輸效率。利用儀器優(yōu)化參數(shù)調(diào)整功能，通過(guò)針泵把濃度為0.6 mg/L的MC-LR樣品直接注入離子源，使用毛細(xì)管出口電壓和錐孔電壓優(yōu)化程序，得到最優(yōu)的毛細(xì)管出口電壓165.7 V和錐孔電壓40.00 V。

本方法采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行微囊藻毒素的定量分析。選擇合適的母離子和子離子是保證目標(biāo)化合物獲得最佳靈敏度的重要因素，通過(guò)目標(biāo)化合物的一級(jí)質(zhì)譜圖選擇相對(duì)較大的特征離子作為母離子，可以得到更高的靈敏度。MC-LR的分子式為C49H74N10O12，在一級(jí)譜圖中主要得到[M+H]+的母離子碎片。選定996 m/z作為母離子進(jìn)入離子阱在碰撞誘導(dǎo)解離作用下，產(chǎn)生不同子離子碎片。當(dāng)碰撞能量過(guò)大時(shí)阱中能量高，離子易碎裂，但也使碎片離子更易出阱；相反能量過(guò)低時(shí)，離子在阱中相對(duì)穩(wěn)定，母離子不易打碎，產(chǎn)生子離子碎片過(guò)少。根據(jù)以上原因，觀察不同能量二級(jí)質(zhì)譜圖產(chǎn)生的碎片離子，選擇0.9 V，此時(shí)可以保證獲得最佳靈敏度。圖2為不同碰撞電壓下的二級(jí)質(zhì)譜圖。選擇定量離子553，599，978 m/z，對(duì)其加合進(jìn)行定量，見(jiàn)圖3。

2.2 線性、檢出限和回收率試驗(yàn)

圖2 不同碰撞電壓下的二級(jí)質(zhì)譜

精密稱取MC-LR10.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級(jí)將其稀釋成 0.600，0.200，0.10，0.050 mg/L 的濃度。在上述檢測(cè)條件下測(cè)定，以峰面積對(duì)應(yīng)不同濃度進(jìn)行線性回歸計(jì)算，回歸方程為y=-12235+3729 476x，相關(guān)系數(shù) r=0.999。

按照信噪比（S/N≥10）作為定量限進(jìn)行試驗(yàn)，得到該化合物MC-LR的定量限為0.01 mg/L，對(duì)1000 ml水樣富集濃縮到1 ml，該方法定量限為0.00001 mg/L，能夠滿足地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB3838-2002和生活飲用水GB/T5749-2006 MCLR的控制標(biāo)準(zhǔn)限值0.001 mg/l，并且優(yōu)于國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)限30倍。

取同一水樣1000 ml為本底，分別加入0.100和0.060 μgMC-LR的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2的步驟對(duì)該加標(biāo)樣品進(jìn)行前處理，并分析測(cè)定。對(duì)其結(jié)果進(jìn)行計(jì)算得出回收率分別為91.26%和70.53%。

2.3 實(shí)際樣品分析

對(duì)2009年6月遼河流域省界斷面福德店?yáng)|、福德店西、王奔、兩家子和后義和進(jìn)行含量檢測(cè)，結(jié)果均未檢出微囊藻毒素，低于地表水控制標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

圖3 MC-LR的MS(2)

本實(shí)驗(yàn)利用全自動(dòng)固相萃取裝置對(duì)樣品進(jìn)行富集、濃縮，選擇甲醇-水作為流動(dòng)相，使用液相色譜-離子阱質(zhì)譜，建立MC-LR的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)的檢測(cè)方法。該方法降低了背景噪音、靈敏度高、選擇性好，回收率高且穩(wěn)定，線性關(guān)系（r=0.999）和回收率（71%～91%）等方法學(xué)指標(biāo)較好，檢出限能完全滿足我國(guó)地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)生活飲用水的控制標(biāo)準(zhǔn)。此方法用于遼河流域省界斷面水樣的檢測(cè)，在5個(gè)水樣中MC-LR均未檢出。

［1］殷麗紅.微囊藻毒素致肝癌研究進(jìn)展［M］.國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)，2005，32(3)：170-174.

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［3］BARCO M,FLORES C,RIVERA J,et al.Determination of microcystin variants and related peptides present in a water bloom of Planktothrix(Oscillatoria)rubescens in a Spanish drinking water reservoir by LC／ESI—MS［J］.Toxicon，2004,44(8)：881-886.