利用大孔樹脂純化荷葉黃酮動態(tài)吸附條件的研究

安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院 陳佳佳 王在貴＊ 劉朝良 張 璐 方龍發(fā)

荷葉甘、平、無毒，具有消暑、清肺等作用（劉嵩，2006）。研究表明，荷葉中有效成分含量豐富，除含有碳水化合物、脂類、蛋白質(zhì)等常規(guī)化學成分外，還富含具有生物活性和生理功能的黃酮類化合物（宛曉春，2003）。它是大多數(shù)氧自由基的清除劑，可以提高SOD（超氧化物歧化酶）的活力，減少脂質(zhì)過氧化物丙二醛（MDA）及氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）的生成（張蕾，2007；唐裕芳等，2004；余以剛等，2001），防治心血管疾病等作用（陳健芬等，2003；黃阿根等，2000）。此外荷葉黃酮還具有很強的降脂、減肥等功效，除可作為心血管疾病防治的原料藥，還可廣泛應用于功能性食品、保健食品和飲料中，目前已經(jīng)被中華人民共和國衛(wèi)生部列入藥食同源的名單（陶波等，2001）。

由于荷葉黃酮具有多種功能而越來越受到廣大學者的關(guān)注。大孔吸附樹脂柱色譜應用于荷葉黃酮的分離純化具有加工成本低、設備簡單、節(jié)約能耗、可再生能力強等優(yōu)點，為廣大研究與生產(chǎn)廠家的首選材料（唐德智，2009；肖文軍等，2007）。本試驗以荷葉為原料，對幾種大孔吸附樹脂分離荷葉黃酮技術(shù)參數(shù)進行系統(tǒng)研究，獲得荷葉黃酮柱分離純化的參數(shù)，為荷葉黃酮的研究與工業(yè)化開發(fā)利用提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 荷葉干品（購自合肥為民大藥房 ），X6、HP-20、AB-8、HPD-100、 無 水 乙 醇 、NaOH均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 荷葉黃酮的提取 參照康璇等（2009）的方法，稱取荷葉15 g，用450 mL 60%的乙醇浸泡，80℃水浴，提取3 h，過濾，濾液濃縮蒸發(fā)至200 mL，冷卻，后離心得到荷葉初提物，測定其含量并用95%乙醇將其配置成3 mg/mL的標準液。

1.2.2 樹脂的預處理 稱取20 g濕樹脂倒入燒杯，先用體積分數(shù)95%乙醇充分浸泡一夜，用乙醇洗數(shù)次至洗出液加適量水無白色渾濁，再用去離子水不斷沖洗直到無酒精味且洗出液澄清，然后轉(zhuǎn)入酸堿處理，即先用體積分數(shù)5%的HCl溶液浸泡3 h再用去離子水洗滌數(shù)次直到pH呈7.0左右，用5%NaOH溶液浸泡3 h，最后用去離子水洗至pH值為7.0左右。

1.2.3 荷葉黃酮的純化

1.2.3.1 最佳吸附與解吸樹脂的選擇 本試驗以上述荷葉黃酮標準品作為對照品測定幾種大孔吸附樹脂對黃酮的吸附效果。選用AB-8、HPD-100、HP-20及X-5樹脂按方法1.2進行預處理。經(jīng)過預處理的4種大孔樹脂去表面水后，各稱取2份，每份5.0 g，分2組放置于具塞磨口錐形瓶中，分別加入濃度為3.0 mg/mL的荷葉黃酮對照液40 mL，將三角瓶放在振蕩器上振蕩，使樹脂充分吸附黃酮24 h后過濾測定濾液中荷葉黃酮的含量，吸附了黃酮的樹脂加入95%乙醇40 mL，振蕩充分解吸24 h，得到解吸液，測定解吸液中黃酮的含量，計算靜態(tài)吸附量、解吸量與解吸率。1.2.3.2 HP-20樹脂對荷葉黃酮的動態(tài)吸附效果研究 根據(jù)1.2.3.1的試驗結(jié)果，選擇大孔吸附樹脂（HP-20）進行上樣流速、上樣液濃度、pH、解吸曲線以及洗脫劑的濃度動態(tài)吸附效果試驗。先用緩沖液將樹脂調(diào)至pH 5.0后，利用漏斗將預處理好的樹脂裝入玻璃層析柱（1 cm×20 cm）中，柱床體積為（BV）10.0 mL。裝柱要讓樹脂隨著緩沖液慢慢沉下，柱床緊實無氣泡。利用恒流泵將黃酮提取液上柱，控制一定流速，收集所有流出液，測定其體積和濃度。

吸附量=上樣液濃度 （mg/mL）×上樣液體積（mL）－流出液濃度（mg/mL）×流出液體積（mL）；

使用一定體積分數(shù)的乙醇溶液進行解吸，控制一定流速，分步收集洗脫液（5 mL/管），測定每個收集管內(nèi)洗脫液的總黃酮含量，計算并繪制洗脫曲線。

解吸率=洗脫液體積 （mL）×洗脫液濃度（mg/mL）/吸附量。

2 結(jié)果分析

2.1 吸附樹脂的選擇 按方法1.2.3.1測定4種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附效果，結(jié)果見表1。

表1 4種大孔樹脂的靜態(tài)吸附效果

由表1可以看出，4種樹脂中X-5樹脂的吸附量最高，當原液濃度為3 mg/mL時，吸附量為48.00 mg，但其解吸量僅為 38.08 mg，解吸率為79.3%，而AB-8樹脂，解吸率為95.6%，解吸率最高，但是其吸附量只有32.08 mg，故這兩種樹脂效果相對較差。綜合比較可知，吸附與解吸效果相對較好的樹脂是HP-20，盡管其解吸率較AB-8樹脂低，但其吸附量較高，為45.84 mg，僅次于X-5樹脂，且其解吸量在4種樹脂中最高，為41.20 mg，因此選擇HP-20樹脂進一步做動態(tài)吸附試驗研究。

2.2 HP-20樹脂的動態(tài)吸附效果

2.2.1 pH值的影響 用酸或堿將荷葉總黃酮提取液調(diào)至 pH 3.62、4.24、5.40，同時將樹脂調(diào)至相應pH值后再上樣，測定吸附與解吸的黃酮含量，結(jié)果見表2。由表2可見，pH 4.24時，HP-20對荷葉總黃酮有較大的吸附量，故選擇在弱酸或酸性條件下進行吸附。

表2 對吸附量及解吸率的影響

2.2.2 上樣液濃度的影響 將荷葉總黃酮的濃縮液加水分別稀釋成0.30、0.50 mg/mL和 0.70 mg/mL 3種濃度后分別上樣。結(jié)果見表2。表2表明，上樣液濃度較低時，吸附量較小，隨濃度的增大，吸附量也增大，當上樣液濃度達到0.70 mg/mL時，吸附量增加不明顯，上樣液濃度控制在0.50～0.70 mg/mL較合適。

2.2.3 流速的影響 利用恒流泵控制流速，分別以 0.70、1.50、2.3、3.1 mL/min 進行上樣。 結(jié)果見表2。表2表明，當流速加到2.3 mL/min時，樹脂的吸附量明顯下降，流速過慢時，雖然吸附量增加，但導致循環(huán)周期延長。因此，控制在1.50 mL/min較理想。

2.2.4 洗脫劑體積分數(shù)的選擇 以不同體積分數(shù)的乙醇水溶液作為洗脫劑進行梯度洗脫，每次收集40 mL的洗脫液，將洗脫液混勻后測得其中的總黃酮含量，結(jié)果見表2。從表2可以看出，乙醇體積分數(shù)越高，洗脫效果越好，當用體積分數(shù)達到80%以上的乙醇水溶液洗脫時，已經(jīng)可以有很好的洗脫效果。

2.2.5 HP-20樹脂的解吸曲線 準確稱取荷葉黃酮對照品配成1.0 mg/mL的溶液，10 mL樹脂處理25 mL（1.0 mg/mL）的料液，流速1.5 mL/min上樣，吸附后用蒸餾水洗后，再分別 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 BV 的 95%乙醇溶液洗脫， 測定每個流出液所洗脫下來的荷葉黃酮的含量，以洗脫液總體積對洗脫下來的荷葉黃酮的總量作洗脫曲線。結(jié)果見圖1，隨著乙醇洗脫體積的上升，黃酮的解吸量增加，當洗脫體積小于2.5 BV時，洗脫量與洗脫體積呈正相關(guān)關(guān)系，當洗脫體積大于3 BV時，洗脫體積對洗脫量基本無影響，從節(jié)約成本的角度出發(fā)，使用3 BV的洗脫液即可將荷葉黃酮較大部分洗脫下來。

圖1 HP-20樹脂的洗脫曲線

3 小結(jié)

通過以上試驗，得到了大孔吸附樹脂HP-20對荷葉總黃酮的最佳吸附條件是提取液總黃酮含量為0.50～0.70 mg/mL，上樣流速為1.5 mL/min，提取原液最適pH為4.3左右，這是由于總黃酮化合物為多羥基酚類，呈弱酸性，因而可達到較好的吸附效果。在這些條件下，樹脂對荷葉總黃酮的吸附量可以達到5.20 mg/mL，通過使用不同體積分數(shù)的乙醇進行洗脫，發(fā)現(xiàn)體積分數(shù)越高的乙醇水溶液洗脫效果越好，當用體積分數(shù)達到80%的乙醇水溶液洗脫時，解吸率已經(jīng)達到了89.9%，洗脫效果已經(jīng)相對較好。大孔樹脂HP-20具有物理化學穩(wěn)定性，對荷葉總黃酮吸附選擇性強，富集效果好，解吸條件溫和，且HP-20再生簡便，使用周期長，是一種理想的富集純化荷葉總黃酮的主材料。

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