不同油脂對瘤胃微生物體外產(chǎn)氣及其區(qū)系動態(tài)變化的影響

揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 郝志敏 王 曙 王 龍 王 晗 王洪榮＊

在反芻動物生產(chǎn)實踐中，植物油脂是高溫與高產(chǎn)季節(jié)良好的能量飼料，同時還能夠調(diào)控瘤胃微生物各區(qū)系的比例和微生物的發(fā)酵，改變瘤胃微生物的發(fā)酵模式，從而減少甲烷的發(fā)酵產(chǎn)量、提高飼料資源的利用效率。但植物油脂調(diào)控瘤胃微生物過程中微生物活力的動態(tài)變化規(guī)律還不十分明了。為此，本試驗擬在體外培養(yǎng)體系中添加花生油、菜油、玉米油和豆油等不同結(jié)構(gòu)的植物油脂進(jìn)行體外培養(yǎng)，旨在解析不同油脂對瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)氣、微生物各區(qū)系活力的動態(tài)變化等影響的規(guī)律，為在實際生產(chǎn)中恰當(dāng)應(yīng)用油脂提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 試驗動物是來自揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)牧場安裝有永久性瘤胃瘺管的3只徐淮白山羊，試驗羊單舍飼養(yǎng)以玉米+豆粕、羊草為日糧常規(guī)飼養(yǎng)，自由清潔飲水，用于采集瘤胃液。

1.2 瘤胃液采集 用裝有40目尼龍濾網(wǎng)的真空負(fù)壓裝置于飼喂后3 h在3只瘺管羊瘤胃共采集450 mL瘤胃液，裝入內(nèi)部預(yù)溫瓶迅速帶回實驗室，經(jīng)雙層紗布過濾后通CO2氣體39℃待用。

1.3 試驗底物設(shè)計 選用纖維素、酪蛋白、淀粉等為培養(yǎng)底物，分別添加4%的菜籽油、豆油、花生油和玉米油等為A、B、C、D四組，每組2個重復(fù)。具體見表1，另外設(shè)一空白對照組。

表1 四組培養(yǎng)底物的配方 g

1.4 體外發(fā)酵裝置 使用250 mL錐形瓶作為培養(yǎng)瓶，瓶塞采用設(shè)有三個通路的橡皮塞，一個持續(xù)供應(yīng)CO2，一個進(jìn)行氣體交換，一個取樣通路。

1.5 人工唾液鹽配制 按照Menke和Steingass（1988）的方法配制。

1.5.1 緩沖試劑和常量元素溶液——A液 稱取K2HPO4·3H2O 382.51 mg，KH2PO4292 mg，（NH4）2SO4480 mg，NaCl 200 mg，MgSO4·7H2O 100 mg和Na2CO34000 mg。將上述試劑溶解混合后加入蒸餾水定容至1000 mL。該溶液在使用前一天配制待用。

1.5.2 微量元素溶液——B液 準(zhǔn)確稱取Na4·EDTA 500 mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 200 mg，MnCl4·4H2O 200 mg，ZnSO4·7H2O 10 mg，H3BO330 mg，CoCl2·6H2O 20 mg，CuCl2·2H2O 1 mg，NiCl2·6H2O 2 mg和NaMoO43 mg。將上述試劑溶解混合后加蒸餾水定容至1000 mL。持續(xù)通入CO218 h后，蓋嚴(yán)瓶口，置于冰箱備用。

1.5.3 還原劑溶液——C液 稱取25 g Na2S·9H2O，加80 mL蒸餾水溶解后在100 mL容量瓶中定容至100 mL，持續(xù)充入CO220 min后，蓋嚴(yán)瓶口，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.5.4 維生素溶液——D液 稱取硫胺素20 mg，泛酸鈣 20 mg，煙酸胺 20 mg，核黃素 20 mg，吡哆醇20 mg，生物素0.2 mg，對氨基苯甲酸1 mg，葉酸 0.125 mg，四氫葉酸 0.125 mg，將上述試劑溶解混合后加蒸餾水定容至1000 mL。

1.5.5 緩沖液制備 準(zhǔn)確量取782.4 mL A液，8 mL B液，經(jīng)充分混合后持續(xù)通入CO218 h，并于培養(yǎng)前1 h加入1.6 mL C液，以及D液8 mL，充分混合，持續(xù)通入CO2氣體10 min，蓋嚴(yán)瓶口，置于恒溫水浴中預(yù)熱至39℃待用。

1.5.6 瘤胃液采集與培養(yǎng)液的配制 飼喂后1～2 h在三只瘺管羊瘤胃分別采集瘤胃液約200 mL，裝入內(nèi)部預(yù)溫保溫瓶迅速帶回實驗室，通CO2，置于39℃水浴中保溫。在培養(yǎng)開始前以2∶1的比例先后加入人工唾液鹽和瘤胃液配制成培養(yǎng)液，沖CO2后密封并于39℃水浴待用。

1.6 體外培養(yǎng)與產(chǎn)氣試驗

1.6.1 體外培養(yǎng)與取樣設(shè)計 取1.2 g底物，放入錐形瓶，加入120 mL培養(yǎng)液，39℃水浴搖床（50 r/min）培養(yǎng)；分別在培養(yǎng)后 0、4、8、12、16、24 h 取樣，每次取約10 mL培養(yǎng)液，分別裝入2支5 mL的離心管中，其中1支立即離心取上清測定總脫氫酶酶活、另外1支立即-20℃冷凍保存，待分離微生物與微生物DNA的測定。

1.6.2 產(chǎn)氣試驗 取200 mg底物，以長柄勺置入注射器底部，再加入30 mL培養(yǎng)液，39℃水浴搖床（50 r/min）培養(yǎng)；在 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24 h和36 h時讀取產(chǎn)氣量，并注意注射器氣體量滿后放掉氣體。

1.7 測定指標(biāo)及方法

1.7.1 總脫氫酶測定 取100目尼龍布過濾的新鮮瘤胃液2 mL于試管中，加入0.2 mL 1.5%的氯化三苯四氮唑（TTC）反應(yīng)，而對照管先加入5 mL異丙醇抑制酶反應(yīng)。在厭氧條件下恒溫水?。?8～39℃）10 min。處理組加入5 mL異丙醇終止反應(yīng)后，以4000 r/min離心10 min。上清液稀釋 15倍，于分光光度計在485 nm處比色。定義在38.5℃、pH 6.8條件下，每分鐘引起測定液吸光度上升0.1的酶量為1個酶活單位?；盍挝唬║/mL）=（樣品A485 nm/min-對照 A485 nm/min）×15。

1.7.2 微生物分離及其DNA的測定 微生物分離原理：由于各區(qū)系微生物的大小、密度不同，因此采用差速離心可以分離。

微生物的分離具體步驟：參考Czerkawshi（1976）、Martín-Orúe 等（1998）、歐宇（2003）等的方法。（1）原蟲：取瘤胃液加等體積生理鹽水置于恒溫（39℃）水浴鍋中震蕩（125 r/min）水浴孵育 60 min，并輔以攪拌；再經(jīng)4層紗布過濾，濾液離心（150 g，10 min），收集沉淀為原蟲，用生理鹽水洗滌兩次后用生理鹽水懸浮，-20℃貯存待測。（2）細(xì)菌：收集（1）離心后上清液，再高速離心（22000 g，15 min），收集沉淀為細(xì)菌，其余處理同（1）。

微生物DNA測定具體步驟（二苯胺顯色法）：標(biāo)準(zhǔn)溶液：取小牛胸腺DNA鈉鹽以0.01 mol/L氫氧化鈉溶液配成200 μg/mL的DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液。二苯胺試劑：稱取1 g重結(jié)晶二苯胺，溶于100 mL冰乙酸（AR）中，再加入 10 mL過氯酸（60%以上），混勻待用，臨用前加入1 mL 1.6%乙醛溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別取DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6 mL和2.0 mL置于試管中（兩個平行），加入去離子水補(bǔ)到2 mL，分別加入二苯胺試劑4 mL，混勻，60 ℃水浴 60 min，冷卻，混勻，595 nm比色。以各管中的DNA量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定：樣品2 mL，加二苯胺試劑4 mL，反應(yīng)與檢測同上。以樣品的光密度值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相對應(yīng)DNA含量。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件中的One-way-ANOVA進(jìn)行方差分析和LSD多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 對產(chǎn)氣量、總脫氫酶的影響 由表2可見，培養(yǎng)液總脫氫酶、總產(chǎn)氣量與對照組之間有顯著差異，添加油脂的試驗組間也有顯著或極顯著差異 （P＜0.05或P＜0.01）。總脫氫酶以豆油組最高，顯著高于對照組（P＜0.05），其次為玉米油組、花生油組、菜籽油組。表1所示培養(yǎng)液36 h總產(chǎn)氣量在20.60～39.67 mL間變化，以對照組最高，顯著高于玉米油、豆油、菜籽油組（P＜0.05）；花生油組與對照組間差異不顯著（P＞0.05），但數(shù)值上也低于對照組。由圖1可知，隨時間的延長各組產(chǎn)氣量呈現(xiàn)波動變化，各組普遍自10～12 h后產(chǎn)氣量急劇加大，但各組在32～36 h產(chǎn)氣基本低于1 mL，進(jìn)入發(fā)酵的平臺狀態(tài)。從圖1中的變化幅度來看，以對照組與花生油組變化幅度較大、玉米油組次之，而豆油與菜籽油組變化幅度較小。

表2 油脂對培養(yǎng)液微生物DNA、產(chǎn)氣量、總脫氫酶酶活的影響

圖1 體外產(chǎn)氣動態(tài)變化趨勢圖

2.2 對微生物區(qū)系及其動態(tài)變化的影響 由表2可見，36 h培養(yǎng)液原蟲、細(xì)菌、微生物DNA以及原蟲/細(xì)菌區(qū)系比例各組間差異不顯著，添加油脂的試驗組間也沒有顯著差異（P＞0.05）；但由表3可見，在不同的時間點上各組的上述各指標(biāo)都有顯著或極顯著的變化（P＜0.05或P＜0.01）。

由表3可知，培養(yǎng)液原蟲/細(xì)菌區(qū)系比例的動態(tài)變化趨勢較為復(fù)雜。各組基本都在培養(yǎng)開始后下降，至8 h后呈現(xiàn)上升趨勢，但在16 h后又出現(xiàn)下降的趨勢，而且各組的變化幅度不盡一致。其中以對照組原蟲/細(xì)菌區(qū)系比例最高、并持續(xù)在比油脂試驗組高的水平上波動（P＞0.05）；其次以玉米油、花生油等組的原蟲/細(xì)菌區(qū)系比例較高，而豆油與菜籽油組的該指標(biāo)較低。

如表3所示，原蟲、細(xì)菌或微生物DNA在培養(yǎng)開始后隨時間延長呈上升趨勢，至16 h后保持平穩(wěn)或有所下降，原蟲在16 h時最高，細(xì)菌則在8 h或16 h時最高，顯著高于1 h或4 h（P＜0.05或P＜0.01）?？偟奈⑸顳NA為原蟲和細(xì)菌之和，動態(tài)變化趨勢與二者相似。另外，從表3可見，各時間點都以豆油與玉米油組的微生物DNA較高，而有利于微生物總量的提高。

表3 培養(yǎng)液原蟲、細(xì)菌、微生物DNA濃度以及原蟲/細(xì)菌區(qū)系比

3 討論

3.1 油脂對產(chǎn)氣量、總脫氫酶的影響 由試驗可知，對照組總產(chǎn)氣量最高，試驗組的產(chǎn)氣量都低于對照組，這可能是因為油脂對原蟲和甲烷菌有一定的毒害作用 （趙玉華等，2005），導(dǎo)致甲烷菌減少；并且油脂在體外發(fā)酵過程中還可能在不同程度上限制了瘤胃微生物的活性而影響產(chǎn)氣，所以產(chǎn)氣量也會相應(yīng)的減少。試驗組中以不飽和程度最高的D組（豆油組）的產(chǎn)氣量較低（26.67 mL），極顯著低于對照組；而不飽和程度最低的A組（花生油）最高，影響最小。本試驗結(jié)果表明，油脂的不飽和程度越大，對瘤胃微生物的活性、產(chǎn)氣的抑制程度越高。例外的是，B組（菜籽油組）的不飽和程度比D組豆油組低，但其產(chǎn)氣量卻顯著低于豆油組，其原因是否與菜籽油含有的芥酸 （陳蛋等，2007）與培養(yǎng)液中的氨在培養(yǎng)過程中經(jīng)微生物復(fù)雜的作用，形成有毒性的三聚氰酸、芥酸酰胺等物質(zhì)有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步的研究。另外，反應(yīng)微生物活力的總脫氫酶活性也以豆油組最高，顯著高于對照組，而玉米油組次之、花生油組再次之，菜籽油組最低，與總產(chǎn)氣量的高低順序相吻合，表明油脂對微生物的活力與其發(fā)酵產(chǎn)氣活動的調(diào)控效應(yīng)隨著油脂不飽和程度的增加而增加。

3.2 油脂對微生物區(qū)系及其動態(tài)變化的影響微生物包括原蟲、細(xì)菌、真菌和噬菌體等，其中以原蟲和細(xì)菌為主，占瘤胃生物量的90%以上（馮仰廉，2004）。原蟲與細(xì)菌區(qū)系量的高低水平和區(qū)系間的比例，直接關(guān)系到瘤胃代謝的類型和發(fā)酵的效果，從而影響到宿主的消化吸收和飼料的利用效率。報道認(rèn)為，油脂尤其是不飽和脂肪酸可在瘤胃微生物脂酶的作用下發(fā)生水解，產(chǎn)生的游離脂肪酸的不飽和鍵會毒害瘤胃中的原蟲 （Jalcˇ，2009；Jenkins，1993），使其群體生物量減少，進(jìn)而減少其對細(xì)菌的吞噬，而增加細(xì)菌的數(shù)量，表現(xiàn)為區(qū)系生物量的交替消長，而最終可能改變微生物的生物總量及細(xì)菌與原蟲區(qū)系的比例。

總體來看，本研究各組培養(yǎng)液原蟲DNA、細(xì)菌DNA、微生物DNA以及原蟲/細(xì)菌區(qū)系比例等指標(biāo)的均值與對照組差異不顯著，而且油脂試驗組間也沒有顯著差異；但在培養(yǎng)的不同時間點上各組的上述各指標(biāo)都有顯著或極顯著的變化。也表現(xiàn)了培養(yǎng)過程中微生物體系及其動態(tài)變化復(fù)雜性。如：原蟲/細(xì)菌區(qū)系比例基本都在培養(yǎng)開始后下降，這可能是由于培養(yǎng)開始之初，油脂的酯解致使體壁較薄的原蟲受到游離不飽和脂肪酸的影響大于細(xì)菌所致；培養(yǎng)至8 h后呈現(xiàn)上升趨勢，可能是由于原蟲的適應(yīng)性增強(qiáng)或者是細(xì)菌（食物）的增加使得原蟲繁殖相對迅速而導(dǎo)致群體的增加；但在16 h后由于原蟲的自溶現(xiàn)象較細(xì)菌嚴(yán)重而又出現(xiàn)了區(qū)系比例下降的趨勢。而且，不同處理比較可見各組的變化幅度不同，以對照組原蟲/細(xì)菌區(qū)系比例最高并持續(xù)在比油脂試驗組高的水平上波動；其次以玉米油、花生油等組的原蟲/細(xì)菌區(qū)系比例較高，而豆油與菜籽油組的該指標(biāo)較低。這表明油脂在一定程度上調(diào)節(jié)了微生物的區(qū)系，降低了原蟲/細(xì)菌的比例，進(jìn)而調(diào)節(jié)了微生物的發(fā)酵類型，以不飽和程度高的豆油效果較好。

從微生物各區(qū)系的量與微生物的總量來看，原蟲、細(xì)菌或微生物DNA在培養(yǎng)開始后隨時間延長呈上升趨勢，至16 h后保持平穩(wěn)或有所下降，不同處理比較，各時間點都以豆油與玉米油組的微生物DNA較高，其原因可能是原蟲的減少與活性的降低，減少了對細(xì)菌的吞噬量，而有利于微生物總量的提高。結(jié)合上述豆油組微生物DNA和總脫氫酶都最高，而產(chǎn)氣量、原蟲/細(xì)菌區(qū)系比例顯著低于對照組，表明油脂可能通過對原蟲及其吞噬細(xì)菌活動的抑制而增加了微生物總的活力和群體量，但對原蟲和產(chǎn)甲烷菌的負(fù)作用又可能使得其發(fā)酵轉(zhuǎn)向產(chǎn)氣量減少的代謝途徑，而可能減少飼料以甲烷能形式的損失，并以不飽和程度高的豆油效果顯著。

4 結(jié)論

在本試驗所選油脂及其結(jié)果的基礎(chǔ)上認(rèn)為，植物油脂可在一定程度上影響微生物的活力及其發(fā)酵產(chǎn)氣，其效應(yīng)隨著油脂不飽和程度的加大而加大，并以豆油的效果較為明顯。

[1]陳蛋，陳斌，陸道禮，等.近紅外光譜分析法測定菜籽油中芥酸的含量[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2007，23（1）：234 ～ 237.

[2]馮仰廉.反芻動物營養(yǎng)學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2004.2～102，131～143.

[3]歐宇.不同蛋白源對綿羊瘤胃肽釋放的影響及抗瘤胃降解小肽的研究：[碩士學(xué)位論文][D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[4]趙玉華，楊瑞紅，王加啟.瘤胃微生物甲烷生成的機(jī)理與調(diào)控[J].微生物學(xué)雜志，2005，25（5）：68 ～ 73.

[5]Czerkawshi J W.Chemical composition of microbial matter in rumen[J].J Sci Food Agric，1976，27:621.

[6]JalcˇD， Cˇertik M，Kundrikova K，et al.Effect of microbial oil and fish oil on rumen fermentation and metabolism of fatty acids in artificial rumen[J].Czech Journal of Animal Science，2009，5：229 ～ 237

[7]Jenkins T C.Lipid metabolism in the rumen[J].Journal of Dairy Science，1993，76：3851 ～ 3863.

[8]Martin-Orue S M，Balcells J，Zakraoui F，et al.Quantification and chemical composition of mixed bacteria harvested from solid fractions of rumen digesta:effect of detachment procedure[J].Animal Feed Science and Technology，1998，4：269 ～ 282.

[9]Menke K H，Steingass H.Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen flued[J].Animal Research and Development，1988，28：7 ～ 55.