微生物利用木質纖維原料產木聚糖酶研究現狀

宋紅霞, 李秀婷, 孫寶國, 宋煥祿, 朱運平

木聚糖是由β-1,4糖苷鍵相連的木糖基構成主鏈的線性大分子.木聚糖結構復雜常具有復雜的側鏈,它的完全降解需要多種水解酶的參與,其中β-1,4-內切木聚糖(EC.3.2.1.8)以內切方式作用于木聚糖主鏈產生不同長度的木寡糖和少量的木糖,是木聚糖降解中最關鍵的酶[1-2].木聚糖酶在食品、飼料、紙漿造紙、木質纖維原料的生物轉化等領域具有重要的應用價值[1],引起了人們的廣泛關注.許多研究表明[3-5],富含木聚糖的木質纖維原料可誘導木聚糖酶的產生.此類農業(yè)廢棄物作誘導底物能夠有效地降低酶制劑的生產成本,由此產生的木聚糖酶十分適合于工業(yè)應用.在資源日益匱乏的今天,利用廉價的農業(yè)廢棄物生產高附加值的木聚糖酶具有重要的實際意義.本文著重對微生物發(fā)酵木質纖維原料生產木聚糖酶的研究現狀進行綜述.

1　木質纖維原料利用現狀

農業(yè)生產和農產品加工過程產生大量木質纖維類農業(yè)廢棄物,主要包括農作物秸桿、谷殼、果殼及甘蔗渣、醪渣等農產品加工廢棄物.這些農作物廢棄物占農田生物質總產量的50%以上[6],產量非常巨大.2003年我國農作物秸稈的總產量約6.5×108t,其中稻草、玉米秸稈總量達到了4.5×108t[7].目前,我國農業(yè)廢棄物的利用方式比較粗放,主要是作為燃料和飼料,還有一部分被直接還田,大約2/3的農作物秸稈被燃燒、拋棄或閑置,木質纖維原料的利用效率低下.農作物秸稈直接作為燃料燃燒時熱效能僅為10%[8],造成了巨大的資源浪費和環(huán)境污染;木質纖維原料作為飼料普遍存在飼用率低的問題;農業(yè)集約化發(fā)展導致化肥的大量施用,農業(yè)廢棄物還田技術也被人們所忽視[6-9].我國木質纖維原料資源化率低,最根本的原因是對木質纖維原料的認識不足.

木質纖維原料的主要化學成分是纖維素、半纖維素和木質素,除此之外,還可能含有少量的果膠、糖類、蛋白質、脂肪、維生素、微量元素等成分.纖維素是自然界中含量最豐富的多糖,在植物細胞壁中纖維素聚集成微纖維[10].半纖維素是指植物細胞壁除去果膠物質后的殘留物能被15%氫氧化鈉所提取的堿溶性多糖[10].木聚糖是半纖維素的主要成分,在被子植物中占干重的20% ～30%,在農作物中約占25%～45%[10].木質素則是一種復雜的不溶性酚類聚合物,它具有抗化學、真菌、細菌攻擊能力強的特點.在植物細胞壁中,微纖維包埋于半纖維素、木質素組成的基質中,形成了一種致密的結構[1][10](見圖1):半纖維素位于微纖維和木質素之間,半纖維素以非化學鍵與纖維素相作用,并以共價鍵與木質素相連.木質纖維的這種致密的結構對于維持原位纖維的結構完整性有重要作用,同時增強了植物纖維對木質纖維降解酶的抵抗能力.農作物秸稈等木質纖維原料是寶貴的可再生資源,其綜合利用主要有5個方向[7-9]:能源化、肥料化、飼料化、材料化和基質化.其中基質化是指以農業(yè)廢棄物為發(fā)酵底物,進行食用菌培養(yǎng)或微生物發(fā)酵生產酶制劑等高附加值產品.利用農業(yè)廢棄物產木聚糖酶的報道很多,麩皮[11]、麥稈[12]、玉米芯[13]、玉米秸[14]、稻稈[15]、稻殼[16]、高粱桿[17]、甘蔗渣[18]是常見的木聚糖酶誘導物,橘皮[19]、酒糟[20]、葡萄渣[21]等農業(yè)加工廢棄物以及非飼料型雜草[4]等也可以誘導微生物產木聚糖酶.

2　微生物木聚糖酶的產生

圖1　木質纖維的組成示意Fig.1　Woodfiber composition

微生物木聚糖酶多為誘導酶,多種木聚糖是良好的誘導物,除此之外,木寡糖、木糖和木質纖維素殘基也是常見的誘導物,但誘導效果多樣[22].隨著國內外對木聚糖酶的研究的深入,許多能利用農業(yè)廢棄物產木聚糖酶的微生物得到了分離,主要生產菌是嗜熱棉毛菌[13][17]、木霉[23]、曲霉[19]、青霉[12][20]、鏈霉菌[16]和芽孢桿菌[11].目前誘導微生物產木聚糖酶的機制尚未完全明了.Kulkarni[24]描述了木聚糖誘導微生物細胞產木聚糖酶的過程:木聚糖是一種大分子聚合物,不能直接穿過細胞壁,只有降解為小分子片段后才能進入細胞內,進而誘導木聚糖酶產生.在微生物生長過程中,首先分泌出少量組成型木聚糖酶,作用于細胞外的木聚糖產生長度不一的低聚木糖,然后這些低聚木糖在細胞透過酶的作用下進入細胞,誘導木聚糖酶基因開始合成并分泌一些木聚糖降解酶到細胞外.這些酶主要包括:內切木聚糖酶、木糖苷酶、轉糖苷酶,它們一方面繼續(xù)降解木聚糖產生低聚木糖,另一方面降解低聚木糖為二糖.而這些二糖經細胞膜上轉移酶作用進入細胞內誘導產生第二階段的木聚糖酶.

表1　幾種農業(yè)廢棄物的成分分析Tab.1　Analysis of components of several agricultural wastes

相對于純木聚糖而言,農業(yè)廢棄物誘導產酶的過程更為復雜,具體的機理尚不清楚.許多研究表明,麩皮能夠誘導多種微生物產生大量的木聚糖酶[11][30-31],而稻殼[32]、甘蔗渣[33]的誘導效果則相對較差.麩皮的化學成分分析(見表1)表明麩皮中含10% ～14%的可溶性糖,其中的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖分別占42.5%,15.4%,3.1%和2.7%,在發(fā)酵前期這些糖分促進了微生物生長和增殖[30],另外這些單糖本身也可能具有誘導作用[22];麩皮含有36%的半纖維素和超過10%的粗蛋白氮,大量木聚糖的存在充分地誘導了木聚糖酶的產生,而有機氮對木聚糖酶蛋白的形成具有重要的作用[30][34].同時由于麩皮中的木質素含量低,麩皮表面結構比較疏松,有利于營養(yǎng)成分的釋放以及木聚糖酶與底物的接觸.稻殼和甘蔗渣中的半纖維素含量小于20%,木質化程度較高(見表1),木質纖維表面比較致密,不利于微生物對木聚糖的利用,這可能是其誘導效果差的原因[30].將較難利用的農業(yè)廢棄物與麩皮復合,來誘導微生物產酶,因各種營養(yǎng)成分發(fā)揮了協同作用,也會進一步提高產酶能力.A.oryzae FS018[35]可以利用多種農業(yè)廢棄物產生木聚糖酶,當用麩皮與玉米芯進行復合時,產酶水平明顯高于單一碳源.麩皮中纖維素、木素含量低,質地較軟,木聚糖酶與半纖維素的可能較易接近,同時麩皮營養(yǎng)豐富,易被菌體利用.玉米芯中半纖維素含量較高,其中大量的木聚糖能對菌株產酶起到良好的誘導作用,但由于玉米芯質地較硬,有效成分可能不易被菌體利用.當選用復合碳源時營養(yǎng)豐富的麩皮作為主要碳源,促進菌體生長,而玉米芯中豐富的木聚糖,可在菌體生長旺盛的條件下誘導木聚糖酶的大量產生[35].

根據上述分析，現階段分布式儲能項目的經濟性主要影響因素包括：項目投資成本、當地峰谷電價差、峰谷平時段、電池壽命、儲能充放電方式、企業(yè)用電量、生產運行狀況和電池梯級利用及回收成本等。據統計數據顯示，廣東省、江蘇省、上海市等峰谷電價差較大的地區(qū)（一般電價差大于0.75元/kWh），儲能項目已具有經濟性，部分地區(qū)已建設較大規(guī)模的儲能示范項目[6]。

不同木質纖維原料的誘導效果差異很大,引起這種差異的原因可能是:1)不同誘導底物中木聚糖的組成結構差異性,例如麩皮木聚糖的阿拉伯取代基較多[26],可能影響了酶與底物的識別及結合[1].2)農業(yè)廢棄物成分復雜,存在的其他的營養(yǎng)成分如可溶性糖可能對木聚糖酶的產生具有促進或抑制作用[22].3)不同農業(yè)廢棄物顆粒的表面性質、致密程度不同,木聚糖酶與木聚糖接觸以及營養(yǎng)成分的釋放難易程度不同[30].4)木質纖維的降解、木聚糖的暴露需要多種酶的參與,微生物所產生的降解酶系可能存在差異.對同一種微生物來說,不同底物的可降解性能也有所不同.

3　利用木質纖維素原料所產木聚糖酶的概況

微生物發(fā)酵生產木聚糖主要采用兩種方式:固體發(fā)酵和液體發(fā)酵.液體深層發(fā)酵是一項成熟的技術,可以精確地控制通氣、pH、溫度等參數,方便地進行發(fā)酵產酶條件的優(yōu)化.采用搖瓶發(fā)酵、小型發(fā)酵罐發(fā)酵農業(yè)廢棄物生產木聚糖酶的報道非常多[4][11][16][20][36].許多研究發(fā)現液體發(fā)酵的放大比較困難,從250 mL搖瓶培養(yǎng)放大至5 L發(fā)酵罐,Kumar等[36]發(fā)現Thermomyces lanuginosus MC 134的產酶量由3 299 U/mL降至2 009 U/mL.木聚糖酶生產從實驗室水平到實現工業(yè)化生產需大量的投入.固體發(fā)酵是一種環(huán)境友好、低成本的發(fā)酵技術.微生物在潮濕的幾乎沒有自由水的培養(yǎng)基上生長代謝,因此固體發(fā)酵方式更接近微生物自然生長環(huán)境,是生產酶類和次級代謝物包括木聚糖酶的有效方法[12][30].富含木聚糖酶的廉價的農業(yè)廢棄物非常適合作為固體發(fā)酵的底物生產木聚糖酶,固體發(fā)酵方式在絲狀真菌中更為常見.絲狀真菌能在水分含量較低條件下生長,其菌絲能攀附在木質纖維原料表面生長,并滲透到基質內,與其他單細胞的細菌及酵母菌相比,更適合固體發(fā)酵.以棕櫚纖維為固體發(fā)酵底物,土曲霉A.terreus MTCC 8661[37]分泌了高達115 000 U/gds的胞外木聚糖酶.引人注意的是,近來報道了兩種細菌 B.pumilus[30]、Burkholderia sp.[38],它們固體發(fā)酵麩皮產木聚糖酶水平分別達到了25 431 U/gds和5 200～5 600 U/gds.但是固體發(fā)酵具有傳熱傳質不均勻,發(fā)酵參數不容易控制,不容易機械化操作等缺點,限制了其大規(guī)模的應用[3].

微生物誘導產木聚糖酶的機理尚不明確,Dwivedi認為誘導底物木聚糖的高度不均一性是產生同工酶的誘因[4].Chandra R的研究發(fā)現,Aspergillus fumigatus AR1在酸性條件下利用木聚糖誘導時僅產生一種木聚糖酶,在堿性條件木糖誘導時則產生了至少四條木聚糖酶帶[39].不同的誘導底物以及培養(yǎng)條件都可能對不同種類木聚糖酶的合成發(fā)揮作用.木聚糖酶同工酶可能是由不同的基因翻譯而來[40],也可能是同一個基因的不同等位基因翻譯的產物[41];m-RNA前加工、蛋白多肽翻譯后加工等也可能導致同工酶的出現[42].這些同工酶的性質比較相似,而這種復雜的木聚糖酶酶系,增加了木聚糖酶的純化難度.農業(yè)廢棄物誘導木聚糖酶時經常伴隨其他木質纖維降解酶類的產生,在真菌中尤為明顯,例如 A.fumigatus fresenius[15]、A.oryzae 3.042[43]所產纖維素酶相對酶活均超過木聚糖酶的10%,過高的纖維素酶限制了木聚糖酶在紙漿生物助漂中的應用,并增加了純化難度.關于酵母及大型食用真菌產木聚糖酶的研究也有報道[3][18],此類微生物安全性方面具有優(yōu)勢,但總體來說這種來源的木聚糖酶產量一般較低.

農業(yè)廢棄物誘導真菌產生木聚糖酶的現象比較普遍,總體而言,真菌產酶水平相對較高.以高粱桿和玉米芯分別誘導 Thermomyces lanuginosus D2W3[17]和 Aspergillus foetidus MTCC 4898[44]進行固體發(fā)酵產酶水平分別達到了48 000 U/gds和3 065 U/gds.嗜熱棉毛菌Thermomyces lanuginosus是一種高產木聚糖酶的嗜熱絲狀真菌,玉米芯能夠誘導Thermomyces lanuginosus SSBP[13]、 Thermomyces lanuginosus MC 134[36]和Thermomyces lanuginosus SDYKY-1[45]產生超過3 000 U/mL的木聚糖酶.嗜熱擬青霉Paecilomyces themophila J18以5.0%的玉米芯粉為碳源和誘導底物,發(fā)酵5天后產酶水平達到了1 276 U/mL[46].以麥稈為誘導底物進行固體發(fā)酵Paecilomycesthemophila J18[12]產生了18 580 U/gds的木聚糖酶.Thermomyces lanuginosus SDYKY-1和Paecilomyces themophila J18是國內利用木質纖維原料發(fā)酵產木聚糖酶的高產菌.真菌木聚糖酶的最適pH一般在5.0～7.0,分子量多在21 KDa～25 KDa之間[19][47-48],少數微生物能釋放高分子量的木聚糖酶[4][39][49].大多數真菌木聚糖酶的耐熱性能一般,耐熱性能好的木聚糖酶僅見于Thermomyces lanuginosus[13][50]、Paecilomyces themophila[51]、Penicillium oxalicum SAUE-3.510[4]木聚糖酶.Penicillium oxalicum SAUE-3.510[4]所產木聚糖酶的最適pH為9.0,在pH10.0,70℃保溫2小時相對酶活力超過60%,這在真菌木聚糖酶中是比較少見的.酶譜分析表明該菌株共產生121 KDa,77 KDa兩種分子量的木聚糖酶.許多微生物能同時產生兩種或兩種以上的木聚糖酶,例如Aspergillus fumigatus AR1[39]、Streptomyces actuosus A-151[16]等.

細菌木聚糖酶主要來源于芽孢桿菌.許多芽孢桿菌木聚糖酶在耐堿、耐高溫方面具有優(yōu)勢,但大多數芽孢桿菌產酶量較低[3],不能滿足實際應用.近年來一些高產木聚糖酶的芽孢桿菌得到了分離:Bacillus pumilus MK001[11]和Bacillus pumilus ASH[52]分別以麩皮為誘導底物,液體發(fā)酵產酶水平高達2 886 U/mL和5 407 U/mL;而Asha P[30]等篩選到一株堿性耐熱短小芽孢桿菌,該菌株以麩皮為發(fā)酵底物,采用固體發(fā)酵的方式產生了25 431 U/gds的胞外木聚糖酶.短小芽孢桿菌Bacillus pumilus A-30在15 L發(fā)酵罐中發(fā)酵3天產酶水平為400 U/mL[53].多數芽孢桿菌木聚糖酶的最適pH在6.0～9.0之間,最適溫度在55～80℃,并且這些細菌很少產生纖維素酶[38][52-53],因此這些酶在紙漿造紙領域展現了良好的應用前景.農業(yè)廢棄物誘導放線菌產木聚糖酶的報道則相對較少,僅見于鏈霉菌.Streptomyces cyaneus SN32[54]和Streptomyces olivaceoviridis E-86[55]是已報道的可利用農業(yè)廢棄物的木聚糖酶高產菌:產酶水平分別達716 U/mL和1 385 U/mL.放線菌所產木聚糖酶一般不伴隨產生纖維素酶,分子量集中在20～25 kDa或30～55 kDa;鏈霉菌木聚糖酶的最適pH值和pH值穩(wěn)定性分別為pH 5.5～7.0和pH 5.0～9.0之間,最適溫度和溫度穩(wěn)定性分別集中于65～80℃和50～70℃[16][54-55].與真菌木聚糖酶相比,鏈霉菌木聚糖酶在耐熱和耐堿性上具有一定的優(yōu)勢.

獲得一株出發(fā)菌株后,可以通過人工誘變、優(yōu)化發(fā)酵條件提高產酶能力.雖然誘變后的菌株存在回復突變的問題,仍有不少研究者通過人工誘變提高了微生物的產木聚糖酶能力,例如 Thermomyces lanuginosus SK[36]和 Penicillium oxalicum SA-8ITCC6024[4]經物理化學誘變后產酶能力分別提高了1.5和1.87倍.

4　利用木質纖維素原料產木聚糖酶存在的問題及展望

木聚糖酶實現工業(yè)應用需滿足生產成本低、催化活性高、對pH和溫度的穩(wěn)定性好、貯存穩(wěn)定等要求.雖然對木聚糖酶的研究越來越深入,但目前多數木聚糖酶的研究及應用僅存在于實驗室水平,僅有少數木聚糖酶的生產實現了工業(yè)化.其主要原因是:多數微生物所產的木聚糖酶產量較低,不能滿足實際應用;微生物利用農業(yè)廢棄物產酶的機制尚未明了,微生物發(fā)酵生產木聚糖酶的放大比較困難;農業(yè)廢棄物發(fā)酵后的粗酶液中,除了木聚糖酶外還含有其他的酶類甚至是毒素,導致在很多領域直接使用粗酶液無法實現,而后續(xù)的木聚糖酶的純化成本太高;目前多數木聚糖酶在耐酸、耐堿、耐高溫方面性能不足;國內多數研究工作僅著眼于木聚糖酶的產量,對木聚糖酶的特性未能深入研究,木聚糖酶應用特點的探討也不夠深入.

目前已商業(yè)化木聚糖酶的數量不多[3],并且這些酶的最適的作用溫度和pH還難以滿足實際生產中對不同特性木聚糖酶的需要.我國擁有豐富的廉價木質纖維原料,直接利用農業(yè)廢棄物發(fā)酵產酶,將大大節(jié)省木聚糖酶的生產成本,用農業(yè)廢棄物代替木聚糖作為木聚糖酶的誘導底物是大勢所趨.性能優(yōu)良的木聚糖酶生產菌是木聚糖酶實現工業(yè)應用的基礎,因此今后的研究應加強可利用農業(yè)廢棄物產木聚糖酶的菌種篩選和酶應用特點的探討.我國的微生物資源十分豐富,結合實際應用的需求篩選低成本的不同特性的木聚糖酶生產菌株,深入研究其產酶的機理和過程,為木聚糖酶的實際應用提供菌種基礎及理論數據,更好地控制微生物產酶及擴大生產過程,使木聚糖酶在我國各個應用領域均能發(fā)揮巨大作用.