中國不同地區(qū)蜂膠的抑菌性研究

龔上佶, 郭夏麗, 羅麗萍, 付宇新, 徐元君, 陳 濱

蜂膠是意大利蜜蜂(Apis mellifera)采集植物芽苞分泌物或傷口處流出的黏液、樹脂等,并混入蜂蠟和其它分泌物經(jīng)咀嚼加工而成的一種黏稠物質(zhì)[1].近些年來研究者對蜂膠的藥理活性及化學(xué)成分進行了全面的研究,發(fā)現(xiàn)蜂膠具有抗菌性、抗病毒、消炎、保肝、抗癌等廣泛的藥理活性[2-5].由于蜂膠具有重要的醫(yī)藥功效,有很廣泛的應(yīng)用價值,常被做成藥品或保健品.

蜂巢內(nèi)環(huán)境潮濕、溫度適宜、空間狹小,非常適宜微生物的生長,而蜂膠是抑制微生物生長的“功臣”,具有很強的抑菌性[6].蜂膠作為傳統(tǒng)的醫(yī)藥,使用歷史悠久,但目前對中國產(chǎn)蜂膠的基礎(chǔ)研究還比較薄弱,尤其是對中國蜂膠的抑菌性研究不多,研究的菌種也非常有限.

為了對中國蜂膠抑菌性有較全面的了解,本課題組從中國不同省份采集29個蜂膠樣本,研究它們對9種常見菌種(金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、產(chǎn)氣桿菌、大腸桿菌、變形桿菌、青霉、曲霉、毛霉和根霉)的抑菌性.通過研究中國蜂膠醇提物(ethanol extract of propolis,簡稱EEP)對這9個菌種的抑菌圈直徑和最小抑菌濃度,從而直觀且科學(xué)地評價中國蜂膠的抑菌性.并在此基礎(chǔ)上,根據(jù)樣品采集地所屬氣候區(qū)域?qū)?9個樣品分為5類(高原高寒氣候、溫帶大陸氣候、溫帶季風(fēng)氣候、亞熱帶季風(fēng)氣候和熱帶季風(fēng)氣候),分析了不同氣候區(qū)域EEP的抑菌性差異,從而為我國蜂膠應(yīng)用研究及蜂膠作為抑菌劑的商品化提供理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1　實驗材料

1.1.1蜂膠樣品

29種蜂膠樣品分別采自中國23個省份,詳細情況見表1.

表1　不同地區(qū)蜂膠特征[7]Tab.1　Characteristics of propolis from diff erent areas

1.1.2試驗菌種

枯草桿菌 (Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、產(chǎn)氣桿菌 (Clostridium perfringens)、大腸桿菌 (Escherichia coli)、變形桿菌(Poteusbacillus vulgaris)、毛霉 (Mucor racemosus)、青霉 (Penicillium glaucum)、曲霉 (Aspergillus niger)、根霉(Rhizopus nigricans).

1.1.3試劑與儀器

蛋白胨和牛肉膏,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;瓊脂;氯化鈉、葡萄糖(分析純);涂布棒、接種針、酒精燈、超凈工作臺,蘇凈集團安泰公司(SWCJ- 2FD);GZX -DH.600--S--II型恒溫培養(yǎng)箱,上海躍進醫(yī)療器械廠.

1.2　實驗方法

1.2.1蜂膠樣品前處理

將蜂膠樣品置于-18℃條件下冷凍,變硬變脆后打成小碎塊,去除雜質(zhì),用藥材粉碎機粉碎并用1.18 mm的網(wǎng)目過濾,混勻后放于冰箱中備用.

1.2.2蜂膠醇提物的制備

取1 g蜂膠粉末,用60%乙醇溶液按固液比1∶20在35℃提取4 h后過濾,再用相應(yīng)濃度乙醇分3次沖洗過濾,濾液于50℃真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥,得到固態(tài)的EEP,置于-18℃中保存?zhèn)溆?使用時,用乙醇復(fù)溶,配制成20 mg·mL-1的溶液.

1.2.3培養(yǎng)基的制備[8]

肉湯培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、氯化鈉5 g、瓊脂20 g,加雙蒸水至1 000 mL,調(diào)至pH 7.2～7.6.

真菌培養(yǎng)基:蛋白胨 10 g、葡萄糖 40 g、加雙蒸水至1 000 mL,調(diào)至pH 7.1.

1.2.4抑菌圈的測定

采用瓊脂稀釋法測定抑菌圈[9].配制濃度為1.5×108個·mL-1的菌懸液,用5.0麥?zhǔn)媳葷岱ㄐＵ?將200μL的菌種懸濁液加入到固體培養(yǎng)基上,細菌使用肉湯培養(yǎng)基,真菌使用真菌培養(yǎng)基.無菌濾紙圓片(D=5.5 mm)加7μL EEP后,均勻貼在上述培養(yǎng)基上.在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(細菌24 h,真菌培養(yǎng)48 h),測量并記錄抑菌圈直徑,每個菌種重復(fù)3次.

1.2.5最小抑菌濃度的測定[10]

將EEP母液稀釋成不同濃度,加于含有等量菌懸濁液的96孔的平板內(nèi),混合均勻,然后將平板放在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(細菌24 h,真菌48 h),觀察試驗菌生長情況,以不長菌的最小EEP濃度(mg·mL-1)為最小抑菌濃度.

2　結(jié)果與討論

2.1　各地蜂膠對9個菌種的抑菌圈直徑和最小抑菌濃度

各地蜂膠對9個菌種的抑菌圈直徑和最小抑菌濃度實驗結(jié)果見表2.抑菌圈直徑和最小抑菌濃度進行相關(guān)性分析,呈負相關(guān)顯著,說明抑菌圈越大,最小抑菌濃度越小,抑菌性越大.

表2　不同地區(qū)蜂膠醇提物的抑菌圈直徑(mm)和最小抑菌濃度(mg·g-1)Tab.2　Zones of inhibition of EEP from different areas(mm)and MIC(mg·g-1)

2.2　不同氣候區(qū)域EEP對革蘭氏陽性菌的抑菌性

不同氣候區(qū)域EEP,對枯草桿菌的抑菌圈(mm,以下單位相同)平均為:高原高寒(14.2)＞溫帶大陸(13.6)＞溫帶季風(fēng)(12.9)＞亞熱帶季風(fēng)(11.6)＞熱帶季風(fēng)(9.7);對金黃色葡萄球菌的平均抑菌圈直徑基本沒有差異,抑菌圈分別為:9.43(溫帶大陸)、9.42(溫帶季風(fēng))、9.37(亞熱帶季風(fēng))、9.31(高原高寒)和9.25(熱帶季風(fēng));對產(chǎn)氣菌的平均抑菌圈為:溫帶季風(fēng)(9.35)＞溫帶大陸(8.93)＞亞熱帶季風(fēng) (8.89)＞高原高寒 (8.74)＞熱帶季風(fēng)(8.26).

上述結(jié)果表明:不同氣候區(qū)域EEP對革蘭氏陽性菌都具有較好的抑菌性,而對枯草桿菌的抑菌性最強.

2.3　不同氣候區(qū)域EEP對革蘭氏陰性菌的抑菌性

不同氣候區(qū)域EEP對大腸桿菌的平均抑菌圈為:溫帶大陸 (10.41)＞高原高寒 (10.35)＞溫帶季風(fēng)(10.22)＞亞熱帶季風(fēng) (10.19)＞熱帶季風(fēng)(8.47);對變形桿菌的平均抑菌圈為:亞熱帶季風(fēng)(8.09)＞溫帶季風(fēng)(7.78)＞溫帶大陸(7.63)＞高原高寒(6.94)＞熱帶季風(fēng)(6.88).

上述結(jié)果表明:不同氣候區(qū)域EEP對革蘭氏陰性菌的抑菌性沒有對革蘭氏陽性菌強,特別是對變形桿菌的抑菌性很弱;不同的氣候區(qū)域中,熱帶季風(fēng)EEP的抑菌性最弱.

2.4　不同氣候區(qū)域EEP對真菌的抑菌性

不同氣候區(qū)域EEP對毛霉的平均抑菌圈為:溫帶大陸 (11.13)＞溫帶季風(fēng)(10.96)＞高原高寒(10.63)＞亞熱帶季風(fēng)(9.95)＞熱帶季風(fēng)(8.32);對青霉的平均抑菌圈為:高原高寒(10.72)＞溫帶大陸 (10.67)＞亞熱帶季風(fēng)(9.96)＞溫帶季風(fēng)(9.84)＞熱帶季風(fēng) (8.18);對曲霉的平均抑菌圈直徑為:高原高寒(11.75)＞溫帶季風(fēng)(11.62)＞溫帶大陸(10.39)＞亞熱帶季風(fēng)(9.84)＞熱帶季風(fēng)(9.25);對根霉的平均抑菌圈直徑大小為:高原高寒(13.56)＞亞熱帶季風(fēng)(11.83) ＞溫帶大陸(11.98)＞溫帶季風(fēng)(10.82)＞熱帶季風(fēng)(10.46).

上述結(jié)果表明,中國不同氣候區(qū)域EEP對真菌有較強的抑菌性.從氣候區(qū)域來看,高原高寒EEP具有很好的抑菌性,而熱帶季風(fēng)EEP對真菌的抑菌性明顯弱于其他氣候區(qū)域.

2.5　不同地區(qū)EEP對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌的抑菌性比較

不同地區(qū)EEP對革蘭氏陽性菌的平均抑菌圈為9.88 mm±1.47 mm,對革蘭氏陰性菌的平均抑菌圈為8.75 mm±1.56 mm,對真菌的平均抑菌圈為10.01 mm±0.65 mm,可見中國不同地區(qū)EEP對真菌的抑菌性最強,其次為革蘭氏陽性菌,對革蘭氏陰性菌的抑菌性最弱.在這9個菌種中,對變形桿菌的抑菌性最差,對根霉的抑菌性最好.

Dixon[11]認為蜂膠對革蘭氏陰性菌的抑菌性弱是因為蜂膠中的主要成分是植物的分泌物,而植物多受革蘭氏陽性菌的侵害,因此植物分泌的物質(zhì)大多是保護植物免受對革蘭氏陽性菌的危害.還有一種理論由Bendel[12]提出,他認為蜜蜂的巢穴容易受一種瓦螨類寄生蟲的侵害,而這種寄生蟲是一種革蘭氏陽性菌,因此對革蘭氏陽性菌的抑菌性更強.

3　結(jié) 論

1)中國不同地區(qū)EEP對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌都具有較好的抑菌性.對真菌的抑菌性最強,其次為革蘭氏陽性菌,對革蘭氏陰性菌的抑菌性最弱.在文中所用9個菌種中,對變形桿菌的抑菌性最差,對根霉的抑菌性最好.

2)溫帶EEP抑菌性最強,亞熱帶EEP次之,而熱帶EEP最弱.不同氣候區(qū)域蜂膠的EEP抑菌性沒有顯著差異.