苯丙氨酸與對苯醌荷移反應的研究

宋秀麗，李省云，李改芬

（太原師范學院化學系，山西 太原 030031）

苯丙氨酸（phenylalanine）又稱α-氨基化肉桂酸，化學全稱為α-氨基-β-苯丙氨酸，它的應用領(lǐng)域比較廣泛，如孟山公司開發(fā)了以苯丙氨酸及其衍生物為原料合成手性中間體技術(shù)［1］。目前，對于苯丙氨酸含量測定的分析方法主要有：電位滴定法［2］、脫氨酶法［3］、紙層析法［4］、熒光法［5］、雙波長紫外吸收法［6］、雙酶電極法［7］、毛細管電泳法［8］和 HPLC［9］等。利用對苯醌荷移光譜法測定苯丙氨酸含量的方法還未見報道。本文選用對苯醌為電子接受體，研究了苯丙氨酸與對苯醌形成荷移絡(luò)合物的條件，探討了反應機理，并對藥物樣品進行了含量測定，結(jié)果令人滿意。

1 實驗材料

CARY300紫外可見分光光度計（美國Varian）；HH-6電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永鑫實驗儀器設(shè)備廠）；92M-202A-DR電子天平（普利賽斯國際貿(mào)易上海有限公司）；210-酸度計（意大利Hanna）。

2 方法與結(jié)果

2.1 反應機理的探討

苯丙氨酸分子內(nèi)一個N原子上的孤對電子可作為電子給予體，對苯醌作為電子接受體，在水溶液中形成絡(luò)合物?；跍y得絡(luò)合物組成比為1∶1，該荷移反應可表示如下：

2.2 溶液的制備

苯丙氨酸標準溶液：在電子天平上準確稱取0.250 0 g苯丙氨酸（中國藥品生物制品檢定所）于250 mL的棕色容量瓶內(nèi)，加水適量，振搖使苯丙氨酸溶解，用水稀釋至刻度，搖勻配成濃度為1 g/L的溶液；對苯醌乙醇溶液：在電子天平上準確稱取0.250 0 g對苯醌于250 mL的棕色容量瓶內(nèi)，加無水乙醇適量，振搖使對苯醌溶解，用無水乙醇溶解稀釋至刻度處，搖勻，配成濃度為1 g/L的乙醇溶液；三酸緩沖溶液：在100 mL三酸混合液（磷酸、乙酸和硼酸，濃度均為0.04 mol/L）中，在酸度計上，用0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為8.5；溴代十六烷基吡啶溶液：在電子天平上準確稱取20.123 5 g溴代十六烷基吡啶，加500 mL水溶解，振搖至完全溶解即可。所用試劑均為分析純，實驗用水為超純水。準確移取適量苯丙氨酸標準溶液于10 mL比色管中，加對苯醌乙醇溶液0.9 mL，加表面活性劑溴代十六烷基吡啶溶液2 mL，用三酸緩沖溶液稀釋至刻度，搖勻，在90℃水浴中反應30 min，迅速冷卻后，以試劑空白為參比，用1 cm石英比色皿，于339 nm處測其吸光度。

2.3 實驗條件的選擇

2.3.1 吸收光譜 按照實驗方法，用紫外可見分光光度計在200 nm～500 nm之間掃描，并繪制吸收光譜圖，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，苯丙氨酸與對苯醌形成的絡(luò)合物在339 nm處一個有吸收峰，而苯丙氨酸在214 nm處有一個吸收峰，試劑對苯醌在259 nm和288 nm處有兩個吸收峰。

2.3.2 溶劑的影響 選用不同的溶劑，按實驗方法配制溶液，測定相應絡(luò)合物的吸光度，結(jié)果表明，在水與甲醇中反應最好，二者吸光度接近，考慮到環(huán)境污染及價格問題，本實驗采用水為溶劑。

2.3.3 溫度和時間的影響 按實驗方法進行，測定不同溫度下不同反應時間絡(luò)合物的吸光度。從結(jié)果可以看出，在80℃以下反應速度慢，在95℃時很快達到平衡，但吸光度值較小，而在90℃時，在30 min～80 min之間吸光度幾乎不變，說明反應較徹底且到達平衡。本實驗選用90℃和30 min。

圖1 吸收光譜圖

2.3.4 酸度的影響 分別用pH值不同的三酸緩沖溶液，按照實驗方法測定其吸光度。實驗表明，在pH=8.5的三酸緩沖溶液中，背景的影響最小，吸光度較大，所以本實驗選用pH=8.5的緩沖溶液。

2.3.5 試劑用量的影響 按照實驗方法改變試劑對苯醌乙醇溶液的用量，結(jié)果表明，對苯醌的用量為0.9 mL時，吸光度最大。

2.3.6 表面活性劑的影響 按照實驗方法配制溶液，分別加入不同的表面活性劑，測定其吸光度，結(jié)果表明，用溴代十六烷基吡啶溶液時吸光度較大且穩(wěn)定，且溴代十六烷基吡啶溶液用量為2 mL時吸光度值最大。

2.4 重現(xiàn)性的試驗

在選定的最佳條件下，以0.2 mL標準溶液按實驗方法重復測定10次，計算得其相對標準偏差為2.4%。

2.5 絡(luò)合物穩(wěn)定性試驗

在選定的最佳條件下，取適量苯丙氨酸標準溶液按照試驗方法，測定吸光度后，每隔一定時間再測定其吸光度，結(jié)果表明該絡(luò)合物在100 min內(nèi)吸光度值基本不變，穩(wěn)定性較好。

2.6 工作曲線的繪制

按實驗方法，準確移取不同量的苯丙氨酸標準溶液，反應后測定絡(luò)合物的吸光度，并繪制工作曲線，結(jié)果見圖 2。苯丙氨酸含量在 20 μg/mL～60 μg/mL時符合比爾定律，線性回歸方程為A=0.096 4+0.014 3C（C 的單位為 μg/mL），相關(guān)系數(shù) R=0.999 2，表觀摩爾吸光系數(shù)ε=2.4×103L/（mol·cm），桑德爾靈敏度 S=0.070 μg/cm2。

2.7 絡(luò)合物組成的測定

用等摩爾連續(xù)變化法測定絡(luò)合物的組成，結(jié)果表明，苯丙氨酸與對苯醌的絡(luò)合比為1∶1。

圖2 絡(luò)合物的吸光度工作曲線

2.8 樣品的測定及回收率實驗

2.8.1 樣品溶液的配制 在電子天平上準確稱取0.250 0 g苯丙氨酸（天津市大茂化學儀器供應站）于250 mL的容量瓶內(nèi)，加水適量，振搖使苯丙氨酸溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.8.2 樣品測定 準確移取0.2 mL樣品溶液于10 mL比色管中，按實驗方法測定吸光度，并計算苯丙氨酸的含量。另用藥典法測定苯丙氨酸的含量，測定結(jié)果均列于表1中。經(jīng)F檢驗，F(xiàn)=2.37＜F（理論）=19，經(jīng)t檢驗，t=1.58＜t（理論值）=2.78，表明這兩組數(shù)據(jù)比較差異無統(tǒng)計學意義，表明本方法與藥典法測定結(jié)果一致。

表1 藥典法與本法測定苯丙氨酸含量比較

2.8.3 回收率實驗 按照樣品測定方法，在樣品中分別加入不同量的苯丙氨酸標準溶液，用標準加入法測定回收率。其測定結(jié)果見表2，回收率在99.7%～103.0%之間。

表2 回收率測定結(jié)果

3 討論

苯丙氨酸是人體必需的八種氨基酸之一，在人體的代謝過程中具有重要作用。廣泛應用于醫(yī)藥、食品和化工等行業(yè)。在食品行業(yè)中，苯丙氨酸與天冬氨酸縮合形成阿斯巴甜，已廣泛應用于調(diào)味品功能性食品中，它還可以用于焙烤食品中強化了氨基酸且改善食品風味。在醫(yī)藥行業(yè)中，它是醫(yī)藥輸液制品的必需成分，還是合成一些藥物的原料或良好載體，如它是合成一些抗癌藥物的中間體，其原理是根據(jù)腫瘤細胞對氨基酸的特殊要求，以氨基酸為載體，把抗癌藥物的分子或基因載入腫瘤區(qū)，達到既能抑制腫瘤成長又能降低腫瘤細胞毒性的目的，也是生產(chǎn)腎上腺素、甲狀腺素和黑色素的原料。我們選用對苯醌為電子接受體，研究苯丙氨酸與對苯醌形成荷移絡(luò)合物的條件，結(jié)果表明，苯丙氨酸與對苯醌在pH=8.5的三酸緩沖溶液中，90℃水浴加熱30 min，可以生成穩(wěn)定的荷移絡(luò)合物。此荷移絡(luò)合物的λmax=339 nm，表觀摩爾吸光系數(shù)ε=2.4×103L/（mol·cm），在 20 μg/mL～60 μg/mL 的范圍內(nèi)符合比爾定律，用這種方法測定的樣品含量，結(jié)果與文獻方法一致。

［1］李翼新，張超.L-苯丙氨酸生產(chǎn)及應用研究進展［J］.氨基酸和生物資源，2006，28（2）：51-56.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2000：364-365.

［3］范長勝，胡寶龍，楊仁根.苯丙氨酸的脫氨酶法測定［J］.氨基酸和生物資源，1995，17（3）：33-35.

［4］吳文彥.血清中苯丙氨酸的紙層析測定法［J］.遺傳學報，1979，6（1）：154.

［5］Yamaguchi A，Mizushima Y，F(xiàn)ukushi M，et al.Microassay system for screening newborn for galactosemia with use of a fluorometric microplate reader［J］.Screening，1992，1（1）：49-62.

［6］項雷文，鄭檢兵.雙波長紫外吸收法測定L-苯丙氨酸含量［J］.氨基酸和生物資源，2002，24（3）：69.

［7］陳滋青，胡軍，Axel W，等.雙酶電極法測定L-苯丙氨酸的研究［J］.工業(yè)微生物，2000，30（1）：5-8.

［8］楊莉麗，袁倬斌.高效毛細管電泳法在芳香族手性氨基酸與年齡的關(guān)系研究中的應用［J］.分析化學，1999，27（9）：1 065-1 068.

［9］Kand’ár R，Záková P.Determination of phenylalanine and tyrosine in plasma and dried blood samples using HPLC with fluorescence detection［J］.Chromatogr B，2009，877（30）：3 926-3 929.