山西省黃瓜灰霉病菌對(duì)乙霉威的抗藥性檢測

趙曉軍,王美琴,周建波,張 鑫,任 璐

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，山西太原 030032；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030801）

黃瓜灰霉病是保護(hù)地黃瓜的主要病害之一，對(duì)黃瓜生產(chǎn)造成了較大影響。目前，控制該病害的主要手段仍為化學(xué)防治[1-4]。乙霉威（Diethofencarb）是1984年日本住友公司開發(fā)的一種廣譜內(nèi)吸性氨基甲酸酯類殺菌劑，其主要通過根和葉的吸收，在胚芽管中抑制病菌細(xì)胞分裂而使灰霉病得到抑制[5-6]，因其與苯并咪唑類殺菌劑存在負(fù)交互抗性，對(duì)由多菌靈抗性灰葡萄孢菌株引起的蔬菜灰霉病有良好的防效。乙霉威在我國使用近20 a，隨著藥劑使用年限的增加及不合理使用，在田間逐漸出現(xiàn)了乙霉威抗藥性菌株[7-8]，使乙霉威田間防效下降，防治費(fèi)用增加，造成了蔬菜和環(huán)境的嚴(yán)重污染。

黃瓜作為山西省保護(hù)地種植的重要蔬菜品種，近幾年種植面積快速增加，然而，黃瓜灰霉病嚴(yán)重影響了黃瓜的產(chǎn)量。乙霉威作為山西省防治黃瓜灰霉病的常用藥劑，用藥歷史較長，田間防效明顯下降。本試驗(yàn)進(jìn)行了山西省黃瓜灰霉病菌對(duì)乙霉威的抗藥性水平檢測，旨在為山西省科學(xué)合理使用氨基甲酸酯類殺菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試藥劑

96%乙霉威原藥（上海興農(nóng)藥業(yè)公司提供）。

1.2 供試菌株的采集、分離和鑒定

從山西省保護(hù)地黃瓜主要種植區(qū)采集黃瓜灰霉病病瓜和病葉，以棚室為單位采集病樣，1個(gè)棚室采集1個(gè)典型病瓜或病葉，病樣以“采樣地點(diǎn)（縣或村）的大寫聲母字頭＋序號(hào)”命名。

將病樣帶回實(shí)驗(yàn)室，在無菌操作條件下純化保存菌種，以進(jìn)行病原菌抗藥性室內(nèi)檢測。試驗(yàn)參照《真菌鑒定手冊》鏡檢灰霉病菌菌株[9-10]。

1.3 含藥PDA培養(yǎng)基的配制

乙霉威原藥以丙酮為溶劑配成1000 μg/mL的母液，以0.2%的量加入乳化劑Tween 80。母液在4℃冰箱中貯藏，用時(shí)以無菌水稀釋后與培養(yǎng)基按1∶9的比例混合，加入到融化的PDA培養(yǎng)基中充分搖勻，制成含藥平板。

1.4 抗性頻率的測定

其測定采用最低抑制濃度法（MIC），采用Yarden標(biāo)準(zhǔn)，以0.5 μg/mL作為鑒別濃度。用直徑為5 mm的打孔器，在培養(yǎng)2 d的待測菌株邊緣取菌塊接種于含鑒別濃度的PDA平板上，每個(gè)處理重復(fù)3次，放在23～25℃恒溫箱中培養(yǎng)，觀察、記錄菌株生長情況。把不能在鑒別濃度上正常生長的菌株定為敏感菌株，能在鑒別濃度上正常生長的菌株定為抗性菌株。

1.5 抗性水平的測定

灰霉病菌的抗性水平采用周明國等[11-12]的菌落生長速率法測定。用直徑5 mm的打孔器沿灰霉菌菌落生長邊緣切取菌塊，分別放入一系列濃度的含藥培養(yǎng)基平板中心。隨機(jī)取10株敏感菌株，其測試質(zhì)量濃度依次為 0.01，0.05，0.1，0.2，0.4 μg/mL，抗性菌株的測試質(zhì)量濃度依次為1，5，10，100，500 μg/mL；培養(yǎng) 3 d 后用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算出各菌株對(duì)乙霉威的EC50值，根據(jù)抗性系數(shù)分析其抗性水平。

表2 山西省黃瓜灰霉病菌敏感菌株對(duì)乙霉威的的毒力測定

根據(jù)抗性水平，將不同的黃瓜灰霉病菌分為4個(gè)抗性類型（表1）。

表1 抗性類型

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜灰霉病菌株的采集與分離

從山西省8個(gè)市區(qū)的黃瓜主要種植區(qū)采集并分離到176株黃瓜灰霉病菌株，其中，太原市15株；晉中市26株；長治市24株；臨汾市19株；運(yùn)城市33株；晉城市27株；朔州市23株；大同市9株。

2.2 黃瓜灰霉病菌對(duì)乙霉威的抗性頻率

由圖1可知，各市均檢測到黃瓜灰霉病菌的抗性菌株，其中，太原、長治、運(yùn)城和朔州市的抗性頻率較高，超過85%；晉中[13]、臨汾和晉城市也在70%左右；大同市最低，為11.11%。176株黃瓜灰霉病菌株中共有39株敏感菌株，137株抗性菌株，對(duì)乙霉威的總體抗性頻率為77.84%。

2.3 黃瓜灰霉病菌敏感菌株對(duì)乙霉威毒力測定

從表2可以看出，10株敏感菌株對(duì)乙霉威的 EC50值最大為0.410 5 μg/mL，最小為0.039 2 μg/mL，平均為 0.160 1 μg/mL。

2.4 黃瓜灰霉病菌的抗性菌株對(duì)乙霉威的抗性水平

將抗性菌株按照抗性系數(shù)分為低抗（LR）、中抗（MR）、高抗（HR）和特高抗（SR），并計(jì)算出各類型菌株占總檢測菌株的百分比，結(jié)果（表3）表明，除大同市外，其余各市區(qū)均有從LR到HR的菌株；除晉中市和大同市外，其余市區(qū)均檢測到特高抗菌株，其中，朔州市特高抗菌株的比例占到30.4%，其余的均在10%以下。

表3 山西省黃瓜灰霉病菌乙霉威抗性菌株的抗性類型統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)論與討論

山西省蔬菜主要種植區(qū)黃瓜灰霉病菌對(duì)乙霉威的總體抗性頻率為77.84%，除大同市外，各調(diào)查地區(qū)抗性頻率均在65%以上。說明山西省蔬菜主要種植區(qū)黃瓜灰霉病菌已普遍對(duì)乙霉威產(chǎn)生了抗藥性，且抗性程度很高。其原因可能為：山西省保護(hù)地黃瓜種植歷史較長，種植戶普遍使用主要成分為乙霉威的藥劑防治黃瓜灰霉病，且出現(xiàn)了用藥過量和過頻的現(xiàn)象，導(dǎo)致保護(hù)地黃瓜灰霉病菌普遍對(duì)乙霉威產(chǎn)生抗藥性。

大同市蔬菜種植區(qū)的抗藥性很低，原因可能為：大同市地處山西北部，常年氣溫偏低，往年僅在夏季大田種植蔬菜，蔬菜生長季間隔期長，灰霉病發(fā)生較少。近幾年，隨著保護(hù)地蔬菜種植面積不斷擴(kuò)大，為灰霉病菌的發(fā)生和流行提供了有利條件，蔬菜灰霉病害日趨嚴(yán)重，農(nóng)藥使用頻率也不斷提高，因此，所調(diào)查的菌株中也出現(xiàn)了少量抗性菌株，但同時(shí)由于當(dāng)?shù)胤乐位颐共〉乃巹┓N類較多，如苯胺基嘧啶類的嘧霉胺、二甲酰亞胺類的腐霉利等，與乙霉威不存在交互抗性，因此，大同市蔬菜種植區(qū)乙霉威藥劑的使用相對(duì)較少，歷史較短，抗性較低。

建議在山西省對(duì)乙霉威抗藥性嚴(yán)重的太原市、朔州市、臨汾市、運(yùn)城市、晉城市、長治市停用這種藥劑，選用腐霉利、嘧霉胺等與其無交互抗性的藥劑；對(duì)乙霉威產(chǎn)生中抗藥性的晉中市及未產(chǎn)生抗藥性的大同市應(yīng)與其他藥劑輪換或混合使用，減少乙霉威的使用次數(shù)，延長其使用壽命。今后仍需進(jìn)一步監(jiān)測黃瓜灰霉病菌抗藥性的變化動(dòng)態(tài)，及時(shí)提出抗性治理措施。

［1］張志明.復(fù)混肥料生產(chǎn)與利用指南[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.

［2］韓巨才，閆秀琴，劉慧平，等.灰霉病原菌對(duì)速克靈的抗性監(jiān)測[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，23（4）：299-302.

［3］李新鳳，劉慧萍.抗三種殺菌劑灰霉菌株可溶性蛋白和酯酶的電泳圖譜研究[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（4）：6-8.

［4］康萍芝，張麗榮，沈瑞清.木霉菌對(duì)灰葡萄孢菌的拮抗作用[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2008（6）：49-51.

［5］孫茜一.黃瓜疑難雜癥圖片對(duì)照診斷與處方[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006：14-15.

［6］劉長令.世界農(nóng)藥大全（殺菌劑卷）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：253.

［7］紀(jì)明山，程根武.灰霉病菌對(duì)多菌靈和乙霉威抗性研究[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，29（3）：213-216.

［8］王萬立，王勇，劉耕春，等.天津市茄子灰霉病菌的抗藥性檢測[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1998，13（4）：107-111.

［9］魏景超.真菌鑒定手冊 [M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社,1979：259-516.

［10］呂佩柯，李明遠(yuǎn)，吳鋸文，等.中國蔬菜病蟲原色圖譜[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1992：6-13.

［11］周明國，葉鐘音.南京市郊灰霉菌對(duì)苯并咪唑類殺菌劑田間抗性的檢測[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1987（2）：53-57.

［12］張永杰，閆秀琴，韓巨才，等.山西省灰霉病菌對(duì)乙霉威的抗性監(jiān)測[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，23（4）：309.

［13］王美琴，趙曉軍，張鑫，等.黃瓜灰霉病菌對(duì)多菌靈、速克靈及乙霉威的抗性檢測 [J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（8）：853-855，910.