黃心夜合的遺傳多樣性研究

朱秀志，張 華，侯志平

(贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000)

黃心夜合的遺傳多樣性研究

朱秀志，張 華，侯志平

(贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000)

運(yùn)用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)技術(shù)，對(duì)黃心夜合［Michelia martinii(Levl．)Levl．］自然分布區(qū)的6個(gè)自然種群遺傳多樣性進(jìn)行了研究。從100個(gè)隨機(jī)引物中篩選出能產(chǎn)生清晰、穩(wěn)定的多態(tài)性標(biāo)記引物18個(gè)，共檢測出110個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)為96個(gè)，占87.27%;在物種水平上，有效等位基因數(shù)目(Ne)，Nei’s基因多樣性系數(shù)(He)和Shannon表型多樣性指數(shù)(I)分別為1.735 2，0.416 3和0.597 1;總的遺傳變異量(Ht)為0.339 8，其中居群內(nèi)遺傳變異量(Hs)為0.258 7，各居群間的遺傳分化系數(shù)(Gst)達(dá)到0.323 1.應(yīng)用UPGMA法對(duì)遺傳距離進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建樹系圖，結(jié)果表明:黃心夜合自然種群具有較高的遺傳多樣性，其種群間的遺傳差異與其地理分布有關(guān)。

黃心夜合;遺傳多樣性;RAPD;DNA

遺傳多樣性是反映種質(zhì)材料遺傳多樣性的有效指標(biāo)。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)作為一種簡便、快速、易行的分子標(biāo)記，是探索生物居群的遺傳結(jié)構(gòu)和研究生物遺傳多樣性及系統(tǒng)進(jìn)化的重要手段。黃心夜合［Michelia martinii(Levl．)Levl．］，別名夜合花，木蘭科含笑屬喬木樹種。因其材質(zhì)優(yōu)良，多被采伐，故現(xiàn)存數(shù)量稀少。目前，有關(guān)黃心夜合在DNA水平上的遺傳多樣性研究尚未見報(bào)道。筆者對(duì)黃心夜合不同種群和種群內(nèi)遺傳多樣性做RAPD分析，了解其種群層次上的遺傳多樣性水平，為進(jìn)一步合理保護(hù)、利用與開發(fā)其遺傳資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

材料采自四川省沐川縣涼風(fēng)坳森林公園、洪雅縣高廟鄉(xiāng)、平武縣寬壩林場、峨眉山觀心坡、雷波縣涼山和重慶市金佛山黃草坪，共6個(gè)自然種群。每個(gè)種群采集4株～16株個(gè)體，植株間隔至少20 m．采集到的新鮮葉片用活性變色硅膠快速干燥，帶回實(shí)驗(yàn)室放于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 研究方法

1.2.1 植物基因組DNA提取

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法，將提取液中加入適量聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和β-巰基乙醇，對(duì)植物基因組DNA進(jìn)行提取。提取過程中動(dòng)作要迅速，盡量減少樣品與空氣的接觸時(shí)間。提取后用冷的純酒精沉淀，發(fā)現(xiàn)沉淀物立即用細(xì)玻璃棒挑出。晾干后，測定DNA濃度和純度，并通過瓊脂糖電泳檢查DNA的完整性，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選結(jié)果

隨機(jī)引物采用上海生工公司引物(OD=2)，共100個(gè)引物(S1～S20;S41～S60;S81～S100;S161～S170;S261～S270;S351～S360;S501～S510)，經(jīng)預(yù)備試驗(yàn)選擇重復(fù)性強(qiáng)且能產(chǎn)生多態(tài)性、清晰明亮譜帶的18個(gè)引物，對(duì)所有個(gè)體DNA進(jìn)行擴(kuò)增。各引物序列及檢測帶數(shù)見表1.

表118個(gè)RAPD引物對(duì)黃心夜合各居群DNA模板的擴(kuò)增結(jié)果 個(gè)

1.2.3 RAPD擴(kuò)增反應(yīng)

根據(jù)Taguchi法優(yōu)化的結(jié)果對(duì)幾個(gè)主要因子的優(yōu)化比較，確定了PCR的擴(kuò)增反應(yīng)在25 uL反應(yīng)體積中的優(yōu)化反應(yīng)體系成分為:1.5 mmol/L Mg2+，0.8 mmol/L dNTP，240 nmol/L 隨機(jī)引物，80 ng DNA，1.0 U Taq DNA聚合酶(上海生工公司)，1倍的buffer溶液。擴(kuò)增的熱循環(huán)參數(shù)設(shè)定如下:94℃變性3 min 20 s，1個(gè)循環(huán);94℃變性1 min，36℃退火1 min，72℃延長2 min，45個(gè)循環(huán);72℃延長10 min，1個(gè)循環(huán)。設(shè)定儀器自動(dòng)轉(zhuǎn)入4℃以保存擴(kuò)增產(chǎn)物等待檢測。

1.2.4 PCR產(chǎn)物檢測

取10 uL擴(kuò)增產(chǎn)物在含有0.5 ug/mL EB(溴化乙錠)的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為1×TBE，穩(wěn)壓90 V，電泳0.5 h．電泳結(jié)果在紫外分析儀中觀察、記錄、拍照。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

每一隨機(jī)引物重復(fù)1次，根據(jù)各標(biāo)記的遷移率及其有無進(jìn)行1/0記錄，能重復(fù)出現(xiàn)且穩(wěn)定、清晰的RAPD條帶記為1，不出現(xiàn)的條帶記為0，強(qiáng)帶、弱帶的賦值均為1.記錄過程遵循以下原則:只記錄易于辨認(rèn)的條帶，模糊不清的條帶予以排除;電泳道中無法準(zhǔn)確標(biāo)識(shí)的條帶不記錄;遷移率相同但強(qiáng)度不同的條帶，當(dāng)強(qiáng)帶的強(qiáng)度超過弱帶的1.5倍時(shí)，不視為相同的條帶，而是把它們分別計(jì)算。最后得到的數(shù)據(jù)輸入POPGENE32軟件進(jìn)行分析。遺傳距離(D)另按Nei's等的方法計(jì)算:

其中:S——任意兩樣本之間的遺傳相似系數(shù);

Nx，Ny——樣本x和樣本y擴(kuò)增出的DNA片段總數(shù);

Nxy——樣本x和樣本y共有的DNA片段數(shù)。

根據(jù)遺傳距離對(duì)各居群進(jìn)行UPGMA聚類分析，構(gòu)建居群間親緣關(guān)系分支樹系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD產(chǎn)物的多態(tài)性

不同引物擴(kuò)增出來的帶數(shù)不同，18個(gè)引物共擴(kuò)增出110條帶，長度在300 bp～2 100 bp之間，每個(gè)引物產(chǎn)生2條～9條。擴(kuò)增條帶的多少與含量不成正相關(guān)關(guān)系，平均每個(gè)引物約產(chǎn)生6.11條帶。其中96條擴(kuò)增帶具有多態(tài)性，占PCR擴(kuò)增帶總數(shù)的87.27%，與黃山花楸、天目木蘭、三棱櫟等相比，比值較高，但與中國蕓芥、樂昌含笑、海南粗榧及珙桐等物種的多樣性條帶百分比值接近。據(jù)此推測，黃心夜合物種水平上的遺傳多樣性背景較為復(fù)雜，遺傳變異水平較高。

2.2 遺傳多樣性和居群分化程度

基于18條RAPD引物所擴(kuò)增出的多態(tài)條帶，利用POPGENE32軟件在假設(shè)遺傳平衡時(shí)計(jì)算有效等位基因數(shù)(Ne)，Nei’s基因多樣性(He)和Shannon表型指數(shù)(I)等指標(biāo)見第15頁表2.

表2 黃心夜合遺傳多樣性與居群遺傳結(jié)構(gòu)

由表2可知，在物種水平上，有效等位基因數(shù)目(Ne)，Nei’s基因多樣性系數(shù)(He)和 Shannon表型多樣性指數(shù)(I)分別為1.735 2，0.416 3和0.597 1，比樂昌含笑高。總的遺傳變異量(Ht)為0.339 8，其中居群內(nèi)遺傳變異量(Hs)為0.258 7，各居群間的遺傳分化系數(shù)(Gst)達(dá)到0.323 1，即在總的遺傳變異中有32.31%的變異存在于居群間，各居群已出現(xiàn)較強(qiáng)的遺傳分化。

2.3 居群遺傳距離

群體間RAPD片段共享性(即遺傳相似度)能夠在一定程度上反映群體間DNA的差異。根據(jù)每個(gè)引物在6個(gè)黃心夜合樣本DNA的擴(kuò)增結(jié)果，算出6個(gè)樣本RAPD片段的平均遺傳相似度。根據(jù)遺傳相似度計(jì)算出遺傳距離，見表3.

表3 任意2個(gè)居群間的遺傳距離

根據(jù)遺傳距離應(yīng)用POPGENE32軟件對(duì)各居群進(jìn)行UPGMA聚類分析，構(gòu)建居群間親緣關(guān)系分支樹系圖，見圖1.

由圖1看出，洪雅居群與其它居群的遺傳距離最大，可能與生境被破壞有關(guān)。除洪雅居群，可以把供試的其它5個(gè)黃心夜合材料聚為兩大類群:東部的重慶金佛山居群和西部的四川居群，后者包括平武居群、沐川居群、峨眉山居群以及雷波居群。

3 討論

圖1 黃心夜合居群間的遺傳距離聚類分析

筆者首次利用RAPD技術(shù)對(duì)黃心夜合種群進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，黃心夜合具有較高的遺傳多樣性。洪雅高廟鄉(xiāng)黃心夜合居群的RAPD產(chǎn)物條帶數(shù)少，多態(tài)性條帶百分比值小，遺傳多樣性指數(shù)也小，與其它居群遺傳距離較遠(yuǎn)，可能與生境被破壞有關(guān)。聚類結(jié)果顯示，東部重慶金佛山居群和西部四川居群被歸為兩類，這一結(jié)果也真實(shí)地反映了兩地黃心夜合植株在外觀形態(tài)上的差異，兩類居群之間表現(xiàn)出較大的遺傳差異與它們的地理距離相關(guān)，即較遠(yuǎn)的金佛山居群與其它地方的居群遺傳距離較大。

遺傳多樣性是反映種質(zhì)材料遺傳多樣性的有效指標(biāo)。黃心夜合目前尚未瀕危，其遺傳多樣性指數(shù)較高，遺傳差異較大，在品種改良中有較大的遺傳潛力。有效保護(hù)并維持黃心夜合的遺傳多樣性，有助于其適應(yīng)環(huán)境變化。而且保護(hù)黃心夜合的基因資源，也是遺傳改良工作的基礎(chǔ)。

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Study on Genetic Diversity of Michelia martini

Zhu Xiuzhi，Zhang Hua，Hou Zhiping
(Basic Medical College，Gannan Medical University，341000 Ganzhou，China)

The genetic variations of six natural populations of Michelia martini from different distribution regions were investigated at the DNA level by employing RAPD．Out of 100 random primers，eighteen random primers were screened，which could generate highly reproducible and clear RAPD fragments for further population analysis ．With these primers，a total of 110 discernible DNA fragments were obtained and of which 96(87.27%)were polymorphic，At species level，the effective number of allele(Ne)was 1.735 2．Nei's gene diversity(He)was 0.416 3 and Shannon index(I)was 0.597 1．Total genetic diversity(Ht)was 0.339 8，and the genetic diversity within populations(Hs)was 0.258 7．The coefficient of gene differentiation(Gst)among populations was 0.323 1．UPGMA map were made according to the genetic similarity and distance of the six populations calculated in this article．The result showed that M．martini had a high genetic diversity．The genetic diversity of M．martini among the six natural populations is primarily related to their geographic distribution．

Michelia martini;genetic diversity;RAPD;DNA

S792.99

A

1007-726X(2011)04-0013-04

2011-09-21

朱秀志(1973— )，男，安徽玉河人，2006年畢業(yè)于西華師范大學(xué)，講師。