胸腺素α原作為約氏瘧原蟲疫苗免疫佐劑的初步研究①

高吉青 劉升發(fā) 韓 偉 張 亭 吳漢洲 王世媛 楊彩霞 洪凌仙 章 軍 周克夫

(廈門大學生命科學學院細胞生物學和腫瘤細胞工程教育部重點實驗室,廈門 361005)

瘧疾目前仍是人類難以攻克的難題。目前藥物治療是治療瘧疾的主要方法,但由于瘧原蟲(Plasmodium)耐藥性問題嚴重,使得藥物治療愈發(fā)困難。瘧疾疫苗的研究成為一個重要課題。約氏瘧原蟲蟲株P.yoelii-17XNL與 P.yoelii-17XL同源,小鼠感染P.yoelii-17XNL可以存活下來,而感染 P.yoelii-17XL后卻死亡,研究發(fā)現,二者最大的不同是紅細胞結合配體(Erythrocyte binding-ligand,EBL)蛋白位置的不同[1]。目前瘧原蟲候選疫苗最主要是裂殖子表面蛋白。

疫苗要發(fā)揮更好的效果需要佐劑的輔助。ProTα作為一種核蛋白,它既參與對細胞周期的調節(jié),促進細胞增殖,也可以調節(jié)免疫應答,促進IL-2、IFN-γ及TNF-α等細胞因子的產生,是一種很好的候選免疫佐劑[2-5]。目前ProTα作為基因疫苗佐劑研究的較多,研究結果表明將抗原蛋白基因和ProTα基因在動物體內共同表達或通過口服DNA疫苗,可以保護實驗動物抵抗致死性感染[6,7]。因此,我們用P.yoelii-17XNL全蛋白作為抗原,ProTα作為佐劑,研究它們對小鼠感染P.yoelii-17XL的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗蟲株 P.yoelii-17XNL與 P.yoelii-17XL由本實驗室-80℃保存。實驗動物為昆明小鼠,6～8周齡,雌性,SPF級,購自廈門大學醫(yī)學院實驗動物中心。重組人前胸腺α原由本實驗室和廈門伯賽基因轉錄技術有限公司共同制備。

1.2 方法

1.2.1 感染兩株瘧原蟲 小鼠隨機分為N、Q兩組,每組6只,N組感染 P.yoelii-17XNL,Q組感染P.yoelii-17XL,腹腔感染1×107個蟲/只小鼠。每天制備薄血膜涂片,計數瘧原蟲血癥水平,觀察記錄小鼠的存活情況。等感染P.yoelii-17XNL的小鼠體內瘧原蟲消失后再感染 P.yoelii-17XL,觀察瘧原蟲蟲株P.yoelii-17XL的生長情況。

1.2.2 P.yoelii-17XNL全蛋白的制備 用P.yoelii-17XNL感染小鼠,感染率較高且瘧原蟲處于裂殖體期時,取血液,獲得瘧原蟲,加蛋白裂解液,超聲破碎5分鐘,離心后取上清低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 小鼠免疫方案 小鼠分四組,每組6只:A組免疫 P.yoelii-17XNL 全蛋白(100 μ g/只)+ProTα(5 μ g/只);B 組免疫 P.yoelii-17XNL全蛋白(100 μ g/只);C 組只注射 ProTα(5 μ g/只);D 組為空白對照(注射相同體積的生理鹽水)。

共免疫四次,第一次與第二次間隔兩周,以后每次間隔一周,免疫采用背部皮下注射。免疫結束一周后,腹腔感染1×107P.yoelii 17XL/只小鼠,每天制備薄血膜涂片,計數瘧原蟲血癥,觀察記錄小鼠的存活情況。

2 結果

2.1 小鼠感染 P.yoelii-17XNL與 P.yoelii-17XL后,感染率與感染時間及存活比較(圖1) 小鼠感染P.yoelii-17XNL與 P.yoelii-17XL后,一般第 3天可以檢出瘧原蟲。N組小鼠瘧原蟲血癥低于60%,20天左右蟲消失,小鼠死亡1只,其他存活下來。Q組感染率最高可達99%,7～8天小鼠全部死亡。

N組存活下來的小鼠,瘧原蟲消失后,再感染致死的P.yoelii-17XL,沒有檢出瘧原蟲。

2.2 免疫過的各組小鼠感染瘧原蟲(P.yoelii-17XL)后存活情況和瘧原蟲血癥比較

2.2.1 各組小鼠感染瘧原蟲后存活情況比較(圖2)通過圖2我們看出,A組小鼠有3只存活下來,存活率為50%,C組有一只小鼠存活,B、D組小鼠全部死亡,說明在ProTα的輔助作用下,P.yoelii-17XNL全蛋白抗原才對小鼠有明顯的免疫保護作用。

2.2.2 各組小鼠瘧原蟲血癥水平及顯著性差異比較(圖3) 通過圖3我們看出第三天各組小鼠已經開始檢出瘧原蟲,且前十天隨著時間的延長各組小鼠瘧原蟲血癥水平逐漸升高,最高可達90%。第五天時B組小鼠瘧原蟲血癥平均值要低于其他三組;但無顯著性差異(P＞0.05)。第6～8天,A組小鼠瘧原蟲血癥平均值要低于其他三組;B組單獨免疫P.yoelii-17XNL全蛋白的小鼠,瘧原蟲血癥平均值低于空白對照組D組。比較第5、6、7天各組小鼠瘧原蟲血癥水平發(fā)現:第5天時,各組小鼠瘧原蟲血癥水平沒有明顯差異(P＞0.05);第6天時,A組低于D組,有顯著性差異(P＜0.05),A組與B、C組無顯著性差異(P＞0.05);第7天時A組低于B、D組,有顯著性差異(P＜0.05),A組與C組沒有顯著性差異(P＞0.05)。這說明在ProTα的輔助作用下,P.yoelii-17XNL全蛋白的免疫保護作用要強于只單獨注射P.yoelii-17XNL全蛋白。

圖1 兩組小鼠瘧原蟲血癥水平Fig.1 The Parasitemia of mouse between two groups

圖2 各組小鼠存活情況Fig.2 The amount of survival mouse in each group

圖3 第3～8天瘧原蟲血癥水平Fig.3 The parasitemia level of mouse in each group in day 3-8

3 討論

免疫反應分為先天性免疫和獲得性免疫,獲得性免疫分為體液免疫和細胞免疫。在瘧原蟲感染過程中,由于瘧原蟲在血液中存在不同時期的克隆,暴露了多種靶蛋白,可以刺激產生體液免疫反應和細胞免疫反應[8,9]。在瘧原蟲感染和免疫研究方面,越來越多的證據表明樹突細胞(Dendritic cells,DC)在瘧疾免疫中起著關鍵性作用,有研究發(fā)現在約氏瘧原蟲(P.yoelii)感染中,DC可以激活子孢子特異性CD8+和CD4+T細胞,從而啟動抗肝期瘧原蟲感染的免疫反應,CD8+T細胞參與抵抗子孢子再次感染,決定再感染時的原蟲血癥水平[10-12]。在約氏瘧原蟲紅內期感染的急性期,DC能呈遞瘧原蟲抗原,上調主要組織相容性復合體(Major histocompatibility complexⅡ,MHCⅡ),CD80和CD86分子的表達和促進CD4+T細胞產生IFN-γ[13]。也有研究表明TOLL樣受體(Toll-like receptors,TLRs)及其信號途徑也參與瘧原蟲感染的免疫應答中[14]。我們推測,感染了非致死的P.yoelii-17XNL瘧原蟲的小鼠,感染過程中可以刺激機體產生體液免疫應答和細胞免疫應答,由于 P.yoelii-17XNL的繁殖率較P.yoelii-17XL要低,使得機體可以抵抗P.yoelii-17 XNL的感染,最終存活下來。存活下來的小鼠通過獲得性免疫在體內留下的記憶細胞,當同源P.yoelii-17XL再次感染小鼠時,機體調動體液免疫和細胞免疫清除了瘧原蟲的感染。

約氏瘧原蟲紅內期抗原能誘導宿主產生抗約氏瘧原蟲再感染的免疫力,誘導機體產生具有保護作用的IFN-γ、IL-2、IL-4等細胞因子,也可以刺激細胞免疫應答[15]。ProTα通過調節(jié)細胞周期和免疫應答,既可以促進細胞增殖,也可以促進IFN-γ、IL-2、IL-4等細胞因子的產生,從而增強抗原的免疫保護作用。ProTα作為胸腺肽的一種組分,已被用于臨床治療腫瘤和免疫低下。也有人研究將其用于蛋白疫苗的佐劑,并取得較好的效果[16]。我們的實驗結果表明,用非致死的P.yoelii-17XNL全蛋白免疫小鼠,用ProTα作為免疫佐劑,可以在一定程度上抵抗致死的P.yoelii-17XL,不但可以提高小鼠的存活率,還降低了瘧原蟲血癥水平,對小鼠有一定的免疫保護作用,比單獨用蛋白抗原免疫小鼠效果要好。近年來美國紐約的Mosoian等[17-19]研究小組通過體外試驗證明ProTα能夠有效抑制HIV-1在宿主免疫細胞內復制,并揭示了其作用機理,他們認為,ProTα是通過TLR-4的信號通路作用,促進TNF-α的產生,從而達到抑制HIV-1的復制,同時發(fā)現,無論是天然獲得的ProTα還是重組人ProTα都有相同的效果,但胸腺素α 1卻無效果。本研究結果對于ProTα是否同樣經過這個通路,達到抑制瘧疾繁殖的效果還需要進一步研究。

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