連用DCS與顯微方法的冷凍干燥系統(tǒng)及實驗研究

王海燕 倫照榮 呂樹申

(1 中山大學化學與化學工程學院 廣州 510275; 2 中山大學生命科學學院 廣州 510275)

冷凍干燥技術，簡稱凍干，就是將含有水分的物質，預先通過降溫凍結成固態(tài)，然后在真空低溫的條件下，通過對凍結物質加熱使其中的水分直接升華和解吸出去，從而得到干物質的技術[1-3]。冷凍干燥法，由于在低溫下進行，物質的理化活性能得到有效保護，干燥后的物質疏松多孔，復水后能迅速恢復原來的狀態(tài)，且凍干過程能排除95%～99%的水分，使干燥后的物質可以在室溫下長時間保存，大大減少了儲存和運輸?shù)牟槐鉡1-3]。因此，冷凍干燥技術廣泛用于保存熱敏性生物樣品，如蛋白質、疫苗及微生物等。

冷凍干燥過程包括預凍、升華干燥和解吸干燥三個階段。預凍是為了在低溫下將物料中游離態(tài)的水凍結成冰，以利于水分的升華，是干燥的準備階段。盡管如此，預凍卻是整個凍干過程中最為關鍵的一步，因為冰晶在預凍過程中形成，且預凍過程中的諸多因素不僅影響冰晶大小和形狀，而且影響后續(xù)的升華干燥速率以及凍干產品質量[4,5]。例如，慢速冷凍時，形成的冰晶尺寸較大，凍干產品的孔徑較大，升華阻力也較小；快速冷凍時，形成較多細小的冰晶，導致冰晶表面積增大，使升華阻力增大。

用于物質凍結特性和微觀結構研究的最常用的方法是差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry, DSC)和顯微鏡觀察法。根據(jù)DSC和顯微鏡的工作原理和特點，將其與冷凍干燥設備的功能有機結合，研制了一種連用DSC與顯微鏡觀察的冷凍干燥系統(tǒng)，并利用此系統(tǒng)，選擇保護劑海藻糖(trehalose, TR)和聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)，對TR/PVA水溶液進行冷凍干燥實驗，考察在不同冷凍速率和冷凍溶液用量等條件下對溶液凍結特性和升華過程的影響。

1 實驗儀器、材料和方法

1.1 冷凍干燥系統(tǒng)

圖1 冷凍干燥系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic of freeze-drying system

如圖1所示，該冷凍干燥系統(tǒng)主要由冷凍系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、DSC熱分析系統(tǒng)、顯微攝像系統(tǒng)和計算機組成。其中，冷凍系統(tǒng)包括凍干室、加熱元件和制冷元件，凍干室為一密閉容器，容器壁上設有透明部分，加熱元件和制冷元件設于凍干室上；凍干室連接真空系統(tǒng)；DSC熱分析系統(tǒng)設于凍干室內部(未圖示)；顯微攝像系統(tǒng)設于凍干室外部，可透過凍干室蓋上的透明部分觀察內部樣品的微觀結構；DSC熱分析系統(tǒng)和顯微攝像系統(tǒng)分別與計算機連接[6]。制冷元件包括傳熱棒和液氮，凍干室的底部與傳熱棒一端連接，傳熱棒的另一端浸入液氮中，從而將冷量傳至凍干室，并以此對凍干室內樣品進行降溫和冷凍。液氮設于升降臺上。傳熱棒浸入液氮中的深度可以通過升降臺自由調節(jié)。上面所述的加熱元件包括電加熱絲和溫控器，電加熱絲均勻安裝在凍干室容器外表面，通過溫控器根據(jù)設定的溫度程序來調節(jié)加熱功率，為凍干室內樣品提供熱源。

1.2 實驗材料

選擇海藻糖(AR, Sigma)和聚乙烯醇(Mw=68000, Sigma)，配制一定濃度的TR/PVA混合水溶液，使海藻糖(TR)的質量濃度為10%，聚乙烯醇(PVA)的質量濃度為1%。分別取0.3mL和1.5mL的TR/PVA溶液裝入生物凍存管中，置于冷凍干燥系統(tǒng)的凍干室中進行冷凍干燥實驗。

1.3 實驗方法

1.3.1 DSC校準

對冷凍干燥系統(tǒng)的DSC測量，采用超純水對熔點Tm(℃) 和結晶潛熱ΔHf(334J/K) 進行兩點校準，降溫速率為1℃/min，升溫速率為0.02℃/min，校準方法如文獻[7]所述。

1.3.2 冷凍干燥實驗

1) 預凍過程。將裝有TR/PVA溶液的凍存管放入冷凍干燥系統(tǒng)的凍干室中進行預凍實驗。首先將溶液在20℃恒溫保持約10min以除去熱歷史，然后分別采用以下2種冷凍方案進行預凍，即:以1℃/min冷凍至-40℃并保持約1h(慢速)；直接投入液氮中，冷凍速率約為280℃/min，然后轉移至-40℃凍干室中放置約1h (快速)。

2) 冷凍干燥。將通過上述冷凍方案凍結的TR/PVA溶液置于-40℃凍干室中，待穩(wěn)定后開始抽真空使其升華干燥，升華溫度為-10℃，升華時間不少于20h，升華結束后在20℃進行解吸干燥。

1.3.3 凍干溶液檢測

1) 凍干溶液顯微鏡觀察 采用Nikon倒置生物顯微鏡觀察凍干溶液的表面和截面，并利用Image Pro 6.0圖像分析軟件測量并計算凍干溶液的孔徑，計為預凍結束后凍結溶液中的冰晶尺寸。

2) 凍干溶液孔隙率測定 從凍干溶液上剪取一塊，測量其厚度，計算其體積為V，質量為W1，將其浸入無水乙醇中至完全飽和，取出稱其質量為W2，無水乙醇的密度極為ρ，那么凍干溶液的孔隙率 P = [(W2-W1)/ρ]/V。

2 實驗結果與討論分析

2.1 冷凍條件對溶液凍結特性的影響

經不同預凍方案的TR/PVA凍結溶液在升溫過程中的DSC曲線如圖2所示。從圖中可以看出，加快冷凍速率，并不影響凍結溶液的熔融溫度，但是凍結溶液的熔融峰面積卻因冷凍速率的加快而下降(表1)，這表明在先前的預凍過程中，加快冷凍速率，使溶液凍結不完全，使凍結水質量分數(shù)，即凍結水占溶液中總含水量的質量分數(shù)下降。凍結水質量分數(shù)可以通過式(1)進行估算:

圖2 不同冷凍方案所得TR/PVA凍結溶液的升溫DSC曲線Fig.2 DSC thawing curves of the frozen TR/PVA aqueous solution obtained from different freezing protocols

表1 冷凍速率對TR/PVA溶液凍結特性的影響Tab.1 Effects of cooling rate on the freeze parameters of the TR/PVA aqueous solution

2.2 冷凍條件對凍干溶液結構的影響

冷凍條件對TR/PVA凍干溶液的結構和形貌的影響，如圖3所示。其中，(A, a)是用量為0.3mL、通過慢速冷凍方案所得凍干溶液的上表面和斷面的顯微鏡照片，(B,b)是用量為1.5mL、通過慢速冷凍方案所得凍干溶液的上表面和斷面的顯微鏡照片，(C,c)是用量為0.3mL、通過慢速冷凍方案所得凍干溶液的上表面和斷面的顯微鏡照片。從圖中可以看出，經冷凍干燥的TR/PVA凍干溶液內部孔洞均勻，互相連通，這是在預凍階段形成的冰晶完全升華后留下的多孔通道。比較(A,a)和(C,c)可以看出，加快冷凍速率，所得凍干溶液的孔徑減小(表2)，網狀孔洞變得致密，盡管孔隙率受冷凍速率的影響很小 (表2)，這表明在先前的預凍過程中，加快冷凍速率使溶液過冷度增大，使成核點增多，且形成的細小冰晶來不及長大[8,9]，因此在凍干溶液中留下致密、尺寸很小的多孔通道。

眾所周知，在預凍階段，冷凍速率會影響溶液凍結時形成冰晶的尺寸，進而影響凍干產品的內部結構，包括孔隙率和孔徑尺寸。在實驗中也發(fā)現(xiàn)使用不同體積的TR/PVA溶液進行冷凍干燥，所得凍干樣品的內部結構會有所差異。如圖3(A,a)和(B,b)所示，采用相同的冷凍方案，冷凍速率都為1℃/min，屬于慢速冷凍，當增加冷凍溶液的體積時，凍干溶液的孔徑尺寸卻隨之減小，孔洞也因而變得致密。這主要是因為在先前的預凍過程中，增加冷凍溶液的體積，使溶液的過冷度增大，導致成核點增多，使冰晶尺寸減小，從而使凍干溶液的孔徑尺寸下降。

圖3 不同冷凍條件所得TR/PVA凍干溶液的表面(A-C)及斷面(a-c)顯微鏡照片F(xiàn)ig.3 Microphotos of the surface (A-C) and cross-section(a-c) of the freeze-dryed TR/PVA solution obtained from different freezing conditions

表2 冷凍速率對TR/PVA凍干溶液結構的影響Tab.2 Effects of cooling rate on the texture of the freezingdryed TR/PVA solution

2.3 冷凍條件對升華率的影響

冷凍條件不同，溶液凍結形成冰晶尺寸就不同，后續(xù)的升華速率也會不同。盡管冰晶尺寸與升華率的關系還沒有測量到，但是根據(jù)努森分子擴散理論[1]可以初步判斷，加快冷凍速率和增大冷凍溶液體積，會使冰晶尺寸減小，導致升華阻力增大。在實驗過程中也發(fā)現(xiàn)，采用相同的升華干燥時間，即升華20h后，只有用量為0.3mL、采用慢速冷凍所得的凍結TR/PVA溶液才可以升華完全。繼續(xù)升華10h后，用量為0.3mL、采用快速冷凍所得的凍結TR/PVA溶液也可以升華完全。而用量為1.5mL的TR/PVA溶液，無論采用快速冷凍還是慢速冷凍，升華總時間長達30h后也未能升華完全。因此，為了提高升華率，優(yōu)化冷凍條件，選擇合適的冷凍速率和冷凍體積是非常有必要的，以便將冰晶尺寸控制在一個合適的范圍。

升華干燥結束后，還需要進行解吸干燥以去除物料中非冷凍水。冰晶升華后留下的多孔通道對解吸干燥速率也有較大的影響。因此，優(yōu)化選擇冷凍條件時，只考慮升華速率是不夠的，還必須考慮對解吸干燥的影響。

3 總 結

通過研制的連用DSC與顯微方法的冷凍干燥系統(tǒng)，對保護劑海藻糖和聚乙烯醇(TR/PVA)水溶液進行冷凍干燥實驗，考察了冷凍速率和冷凍溶液的用量等冷凍條件對溶液凍結特性和升華干燥過程的影響。溶液凍結后形成的冰晶在升華干燥結束后留下多孔通道，因此可以利用顯微鏡研究多孔凍干溶液的微觀形貌，以判斷溶液凍結后冰晶的形成情況。冰晶的大小不僅受冷凍速率的影響，而且與溶液體積有關，加快冷凍速率會導致不完全冷凍并形成大量細小的冰晶，增加溶液體積也會引起過冷度增大，使冰晶尺寸減小，導致升華阻力增大，使升華速率減慢。

本文受中山大學實驗室開放基金(KF200919)項目資助。(The project was supported by the Opening Fund of Laboratory, Sun Yat-sen University (No. KF200919).)

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