產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的革蘭陰性桿菌檢測及其耐藥性研究

吳秋飛

(浙江上虞市中醫(yī)院檢驗科，312300)

由于廣譜抗生素、第三代頭孢菌素等抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，出現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)耐藥株，能水解頭孢噻肟、頭孢曲松等三代頭孢及氨曲南等抗菌藥物，給臨床抗感染治療帶來極大困難，成為臨床關(guān)注的重點［1-3］。本研究收集產(chǎn)ESBLs的革蘭陰性桿菌并對其耐藥情況進行分析，以求為臨床感染性疾病的診治提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株 收集2010年6月至2011年6月我院住院患者中分離的革蘭陰性桿菌371株，質(zhì)控菌株為大腸桿菌 ATCC 25922，銅綠假單胞菌 ATCC 27853。

1.2 儀器與試劑 VITEK-ATB細菌鑒定系統(tǒng)和API細菌鑒定試劑條(法國梅里埃公司);頭孢噻肟/克拉維酸(CTX/CA)及頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CA)復(fù)合紙片(英國OXOID公司);其他藥敏紙片(北京天壇公司)。

1.3 方法 采用VITEK32和雙紙片法檢測ESBLs。雙紙片法是先將含酶抑制劑藥物阿莫西林/克拉維酸(AMC/CA)紙片貼于MH平板，然后在紙片中心距離25mm處貼上CAZ或CTX底物紙片，接種方法同紙片擴散法，35℃孵育18～24 h，任一底物紙片近AMC/CA端抑菌區(qū)加強或雙紙片之間出現(xiàn)協(xié)同敏感區(qū)判定ESBLs陽性。藥敏試驗應(yīng)用VITEK32檢測MIC，根據(jù)NCCLS 2008標準判讀結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS13.0，株數(shù)計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以Kappa檢驗對兩種方法進行一致性評價，Kappa≥0.75一致性極好，0.4 ＜Kappa＜0.75 一致性較好，≤0.4一致性差。

2 結(jié)果

2.1 臨床分離G－桿菌的分布 371株革蘭陰性桿菌中，克雷伯菌85株，占G-菌的22.9%(85/371)，大腸桿菌占21.6%(80/371)，銅綠假單胞菌占17.8%(66/371)，鮑曼不動桿菌占12.4%(46/371)，陰溝腸桿菌占8.1%(30/371)，嗜麥芽窄食假單胞菌占7.8%(29/371)，枸櫞酸桿菌占2.7%(10/371)，其他 G-桿菌占 6.7%(25/371)。

2.2 VITEK32儀器法和雙紙片法檢測 ESBLs的比較:兩種檢測方法檢測ESBLs陽性的結(jié)果比較見表1，經(jīng)χ2檢驗顯示兩種檢測方法對ESBLs的檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=169.4，P ＜0.01)。兩種方法對 ESBLs的檢測一致性較好(Kappa值為0.65)。

表1 VITEK32儀器法和雙紙片法檢測ESBLs的結(jié)果比較(株)

2.3 ESBLs陽性株和ESBLs陰性株對抗菌藥物耐藥率比較 35株大腸桿菌ESBLs陽性菌株對氨芐西林、頭孢噻吩、慶大霉素等藥物呈高比例耐藥，與ESBLs陰性菌株耐藥率比較組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。32株克雷伯菌ESBLs陽性株對氨曲南、頭孢呋新、頭孢噻肟等耐藥率高，與ESBLs陰性菌株組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。本組菌株均對伊米配能較敏感，見表2。

表2 ESBLs陽性菌株和ESBLs陰性菌株耐藥率比較(株)

3 討論

從我院臨床分離到的G-桿菌組成看，最為多見的菌種為大腸桿菌和克雷伯菌，這兩種細菌對頭孢三代和氨曲南等的耐藥性與質(zhì)粒介導(dǎo)ESBLs密切相關(guān)，其ESBLs檢出率分別為43.8%和37.6%明顯高于他國，給臨床帶來極大的治療壓力，產(chǎn)ESBLs細菌的感染成為臨床關(guān)注的重點。因此，尋求快速、準確的檢測方法，對了解產(chǎn)ESBLs細菌的耐藥情況及合理使用抗菌藥物具有重要意義［4-5］。

對比VITEK32和雙紙片兩種ESBLs檢測法實驗結(jié)果顯示，按VITEK32儀器法從臨床分離到的371株G-桿菌共檢出ESBLs菌80株，陽性率21.6%(80/371)，其中大腸桿菌ESBLs檢出率43.8%(35/80)高于克雷伯菌37.6%(32/85)。VITEK儀器法ESBLs檢出率達99%以上，方法簡單、快速、準確，且可以同時發(fā)藥敏試驗和ESBLs結(jié)果的報告，在大、中型醫(yī)院值得推廣使用。

本研究結(jié)果顯示，雙紙片法ESBLs檢出率低于儀器法，與相關(guān)報道結(jié)果一致［6-8］。與儀器法相比，由于雙紙片法價格便宜，紙片容易購買，在一般實驗室應(yīng)用較廣。但雙紙片法檢測結(jié)果易受紙片間距影響，且人工判讀結(jié)果存在主觀性，NCCLS已不提倡使用雙紙片法。

兩種方法的檢測結(jié)果一致性較好(Kappa值為0.65)，但兩種方法對ESBLs的檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=169.4，P ＜0.01)，儀器法檢出率高，滿足臨床上快速、準確、敏感的檢測要求，是更理想的檢測方法。

我們對大腸桿菌ESBLs陽性株做藥敏試驗，結(jié)果表明，ESBLs陽性株對氨芐西林、頭孢噻吩、慶大霉素等藥物高度耐藥，與陰性株比較耐藥率組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義?？死撞鶨SBLs陰性株對氨曲南、頭孢呋新、頭孢噻肟等抗菌藥物耐藥率較低，而ESBLs陽性株對氨曲南、頭孢呋新、頭孢噻肟等的耐藥率明顯升高，耐藥率組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究未檢測到伊米配能耐藥株，但目前伊米配能使用較廣，應(yīng)密切監(jiān)測其耐藥株的出現(xiàn)。

［1］Chatterjee SS，Karmacharyav R，Madhup SK，et al.High prevalence of co-expression of newer beta-lactamases(ESBLs，Amp-C-beta-lactamases，and metallo-beta-lactamases)in gram-negative bacilli［J］.Indian J Med Microbiol，2010，28(3):267-268.

［2］Khalaf V，Eletreby MM，Hanson ND.Characterization of CTX-MESBLsin Enterobacter cloacae，Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae clinical isolates from Cairo，E-gypt［J］.BMC Infect Dis，2009，9(1):84.

［3］Espinal P，Garza-Ramos U，Reyna F，et al.Identification of SHV-type and CTX-M-12 extended-spectrum beta-lactamases(ESBLs)in multiresistant Enterobacteriaceae from Colombian Caribbean hospitals［J］.J Chemother，2010，22(3):160-164.

［4］Johann DDP，Patrice N，Kevin B，et al.Emergence of Enterobacteriaceae producing extended-spectrum-lactamases(ESBLs)in the community［J］.J Antimicrob Chemother，2005，56(1):52-59.

［5］Yum JH，Kim S，Lee H，et al.Emergence and wide dissemination of CTX-M-type ESBLs，and CMY-2-and DHA-1-type AmpC beta-lactamases in Korean respiratory isolates of Klebsiella pneumoniae［J］.J Korean Med Sci，2005，20(6):961-965.

［6］G.Valenza，S.Muller，C.Schmitt，et al.Evaluation of the VITEK 2 AST-N111 card for detection of extended-spectrum beta-lactamases(ESBLs)in Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae，and Klebsiella oxytoca compared to ESBL Etests and combination disk methods［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2011，30(7):869-872.

［7］Grover SS，Sharma M，Pasha ST，et al.Antimicrobial susceptibility pattern and prevalence of extended spectrum beta-lactamase(ESBLs)producing strains of Klebsiella pneumoniae from a major hospital in New Delhi［J］.J Commun Dis，2004，36(1):17-26.

［8］Giamarellou H.Multidrug resistance in Gram-negative bacteria that produce extended-spectrum beta-lactamases(ESBLs)［J］.Clin Microbiol Infect，2005，11(l 4):1-16.