葡萄籽多肽的制備及功能研究

楊碧霞，馮翠萍，張碩，齊海心

（1.山西農業(yè)大學 信息學院，山西 太谷 030800;2.山西農業(yè)大學 食品科學與工程學院，山西 太谷 030801)

葡萄籽多肽的制備及功能研究

楊碧霞1，馮翠萍2，張碩2，齊海心2

（1.山西農業(yè)大學 信息學院，山西 太谷 030800;2.山西農業(yè)大學 食品科學與工程學院，山西 太谷 030801)

本試驗用風味蛋白酶及堿性蛋白酶，以pH值、酶用量及時間為因素，采用三因素三水平L9（33)正交試驗確定葡萄籽多肽制備最佳的酶和酶解條件，結果表明，堿性蛋白酶優(yōu)于風味蛋白酶，堿性蛋白酶的最佳水解條件是pH值為11.5、酶用量為0.9%、水解時間為18h的條件下達到最大水解度46.16%。葡萄籽多肽有很強的清除DPPH·和H2O2的能力，有一定的清除O－2·和抑制脂質過氧化能力，且總還原力隨濃度增加而增加。葡萄籽多肽對金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌1515、黑曲霉和青霉都有較強抑制作用，其抑菌率分別為70.77%、65.28%、59.07%、60.71%、60.71%和50.86%。另外，葡萄籽多肽具有很好的乳化性和乳化穩(wěn)定性。結果表明該多肽中存在抗氧化肽、抑菌肽、表面活性肽。

葡萄籽;多肽;酶;功能

葡萄是世界普遍栽培的和產量較大的水果之一，在中國有兩千年的栽培歷史。葡萄的產量很大，據統計，全世界年產葡萄約6500萬t，我國年產葡萄約200萬t。這些葡萄約80%用于釀酒，13%作為鮮果食用，7%用于加工果汁及其他葡萄產品［1］。葡萄釀酒或進行果汁加工的下腳料主要是葡萄皮與葡萄籽，其中葡萄籽約占鮮果質量的4%～7%［2］，目前國內大多將其免費或廉價出售給農民作飼料或肥料，造成很大浪費。葡萄籽中含有豐富的蛋白質、脂肪、纖維素、礦物質和維生素等營養(yǎng)成分［3～5］。大量科學研究表明，通過選擇適當蛋白酶，控制一定水解度，水解葡萄籽蛋白質可得到大量生物活性多肽，這些生物活性肽易被人體消化吸收，且具有許多獨特生理功能［6］。如何從葡萄籽中提取多肽活性物質，使之成為功能性食品先導化合物，是葡萄籽多肽物質研究中的一個方向。目前對多肽的研究報道較少，所見文獻主要側重在葡萄籽蛋白的制備上。本試驗用酶法制備葡萄籽多肽，并對清除DPPH·、O－2·、H2O2等自由基，抑制體外脂質過氧化，以及其總還原力，抑菌能力和乳化性、穩(wěn)定性等進行研究，旨在為葡萄籽多肽的開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

巨峰葡萄籽：清徐縣葡萄酒廠提供。

1.1.2 試驗菌株

大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，志賀氏菌，青霉，黑曲霉：山西農業(yè)大學食品學院食品安全實驗室提供。

1.1.3 主要試劑

風味蛋白酶（酶活力＞3.5萬·g－1)，堿性蛋白酶（酶活力10萬·g－1)：由南寧恒華道生物科技有限責任公司提供;木瓜蛋白酶：購自北京索萊寶科 技 有 限 公 司;DPPH （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)、Tris（三羥甲基氨基甲烷)，購自美國Sigma公司;鄰苯三酚，硫酸亞鐵，硫代巴比妥酸，SDS（十二烷基硫酸鈉)，H2O2，鐵氰化鉀，三氯乙酸，氯化鐵，以上試劑均為國產分析純;大豆色拉油、雞蛋：市售。

1.1.4 主要儀器與設備

HZQ-C空氣振蕩器 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠;PHS-3C精密酸度計：上海虹益儀器儀表有限公司;JDG-0.2真空凍干試驗機：蘭州科近真空凍干技術有限公司;BS224S型電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司;KDN-08消化爐：上海新嘉電子有限公司;凱氏定氮儀：756型紫外分光光度計：上海光譜儀器有限公司;WFJ2100型可見光分光光度計：尤尼柯（上海)儀器有限公司;HZQF160全溫振蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱東聯電子技術開發(fā)有限公司;YXQ-SG46-280S型不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.2 方法

1.2.1 葡萄籽蛋白提取工藝流程

去油后葡萄籽粉→酶法提取（木瓜蛋白酶)［7］→等電點沉淀→離心→真空冷凍干燥→葡萄籽蛋白質

1.2.2 葡萄籽蛋白質含量的測定

葡萄籽粉中蛋白質的測定采用凱氏定氮法，參照GB5009.5-1985《食品中蛋白質含量的測定》。

1.2.3 葡萄籽多肽的制備

1.2.3.1 工藝流程

稱料→加水高溫蒸煮45min→補水→調節(jié)pH→添加酶制劑→升溫到85℃滅酶10min→調節(jié)pH至中性→Sephadex G-25凝膠純化→冷凍干燥→多肽

1.2.3.2 酶解制備葡萄籽多肽

在溫度恒定的情況下，在每種酶最佳活性范圍內選用pH，酶用量，水解時間為試驗因素，采用三因素三水平正交試驗，根據葡萄籽蛋白質水解度確定最佳水解條件。兩種酶因素水平分別見表1、表2。

表1 風味蛋白酶正交試驗因素水平表Table 1 The table of factors and levels of flavor protease

表2 堿性蛋白酶正交試驗因素水平表Table 2 The table of factors and levels of alkaline protease

1.2.4 功能活性的測定

1.2.4.1 多肽對DPPH·清除作用的測定

清除DPPH·能力測定參照文獻［8］方法。

式中，A0：空白吸光度值;A：517nm下加入樣品的DPPH的吸光度值;Ab：517nm下不加入樣品的DPPH的吸光度值

1.2.4.2 多肽對O－2·清除作用的測定

清除O－2·能力測定參照文獻［9］進行。

式中，ΔA1／Δt－鄰苯三酚自氧化時的反應速率;ΔA2／Δt－加入樣液后鄰苯三酚自氧化的速率

1.2.4.3 多肽對 H2O2清除作用的測定

將不同濃度的樣液溶解在3.4mL的磷酸緩沖液（pH＝7.4)中，加入0.6mL 40mmol·L－1H2O2，搖勻后，在室溫下反應10min，在230nm處檢測其吸光度值。

式中，Asample－被測樣品的吸光度值;Ablank－空白的吸光度值;Acontrol－不加入樣品的吸光度值

1.2.4.4 對體外脂質過氧化抑制作用的測定

體外抗脂質過氧化能力的測定參照文獻［10］方法。

式中，Asample－被測樣品的吸光度值;Ablank－空白的吸光度值;Acontrol－不加入樣品的吸光度值

1.2.4.5 總還原力的測定（TRA)

取1mL試樣，pH 6.6的磷酸緩沖液2.5mL和質量分數1%的鐵氰化鉀溶液2.5mL，混合后在50℃放置20min，加入質量分數10%三氯乙酸2.5mL混合，取混合液2.5mL加入2.5mL蒸餾水和質量分數0.1%的FeCl32.5mL混勻，靜置10 min，在700nm處測定吸光度。

1.2.4.6 多肽乳化活性（EA)的測定

取一定體積濃度為0.5%的多肽液，加入同體積的大豆色拉油，以100 000r·min－1的速度高速攪拌1min，之后分別在0min、10min取樣，以0.1%（w／v)SDS（十二烷基硫酸鈉，pH7.0)稀釋100倍，以SDS為空白，500nm處測定吸光度值，以0min的吸光度值（A0)表示乳化活性（EA)，乳化穩(wěn)定性用ESI表示：

式中，A0－0時刻的吸光值;ΔT－時間差（min);ΔA－ΔT內的吸光值差1.2.4.7 多肽抑菌能力的測定

利用濾紙片法測定抑菌能力。

式中，Dc－處理組的抑菌圈直徑（mm);Dw－未處理組的抑菌圈直徑

2 結果與分析

2.1 蛋白質含量測定

經凱氏半微量定氮法測定，去油后葡萄籽中蛋白質含量為16.8%。

2.2 最佳水解條件的確定

2.2.1 風味蛋白水解酶酶解結果

由表3可見，風味蛋白酶水解葡萄籽蛋白的最佳條件為 A2B2C3，即pH6.5，酶用量為0.15%，水解時間24h，在此條件下水解度為10.67%。極差值表明各因素對水解度的影響主次為B＞A＞C，即酶用量＞時間＞pH。由表4方差分析結果表明，三種因素對水解度的影響差異都不顯著。

表3 風味蛋白酶酶解正交試驗結果Table 3 The results of orthogonal experiment of Flavor protease digestion

續(xù)表3

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

2.2.2 堿性蛋白水解酶酶解結果

由表5可見，堿性蛋白酶水解葡萄籽蛋白的最佳條件為 A3B3C2，即pH11.5，酶用量為0.9%，水解時間18h，在此條件下水解度為46.16%。極差值表明各因素對水解度的影響主次為A＞C＞B，即pH＞時間＞酶用量。由表6方差分析結果表明，酶用量對水解度的影響差異極顯著，pH、時間對水解度的影響差異顯著。

表5 堿性蛋白酶酶解正交試驗結果Table 5 The results of orthogonal experiment of Alcalase protease digestion

表6 方差分析Table 6 Analysis of variance

2.3 功能活性的確定

2.3.1 多肽對DPPH·、O－2·和H2O2的清除能力以及對體外脂質過氧化抑制能力和總還原力

由表7可見葡萄籽多肽對DPPH·、O－2·和H2O2的清除能力以及對體外脂質過氧化抑制作用，這四項指標在試驗濃度范圍，均隨著葡萄籽多肽濃度的增加而增大，當其質量濃度達8g·L－1時，清除率及抑制率分別可達到92.83%、93.10%、42.79%、67.09%;其總還原力也隨濃度增加而增加。表明葡萄籽多糖具有較強的清除自由基能力及一定的抗脂質過氧化能力，且多肽中可能存在抗氧化肽。

2.3.2 乳化活性（EA)和乳化穩(wěn)定指數（ESI)

由表8可知，葡萄籽蛋白質較其多肽有較強的乳化活性，而葡萄籽多肽與葡萄籽蛋白相比有較強的乳化穩(wěn)定性。

表7 葡萄籽多肽對DPPH·、O－2·和H2O2的清除率以及對體外脂質過氧化抑制率和總還原力Table 7 DPPH·、O－2·and H2O2scavenging ability and lipid peroxidation inhibitory activity and total reduction force peptides of grape seed protein and polypeptide（x±SD)

表8 葡萄籽蛋白和多肽乳化活性和乳化穩(wěn)定指數Table 8 The results of EA and ESI of grape seed protein and polypeptide

2.3.3 葡萄籽多肽抑菌能力

葡萄籽多肽的抑菌能力測定結果見表9。由表9可知，40g·L－1的葡萄籽多肽對金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌1515、黑曲霉和青霉都有較強抑制作用，其抑菌率分別可達70.77%、65.28%、59.07%、60.71%、60.71% 和50.86%，其中對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強。說明多肽中可能含有抑菌肽。

表9 抑菌試驗結果Table 9 The antimicrobial activity of grape seed protein and polypeptide

3 討論

利用蛋白酶水解制備多肽具有安全、快速等優(yōu)點，且相對于化學方法來說具有副反應少，條件溫和等特點，且葡萄籽多肽在堿性蛋白酶的作用下具有較高的水解度。由正交試驗結果得出風味蛋白酶在pH值為6.5、酶用量為0.15%、水解時間為24h的條件下達到最大水解度，最大水解度為10.67%，堿性蛋白酶在pH值為11.5、酶用量為0.9%、水解時間為18h的條件下達到最大水解度，最大水解度為46.16%?？梢妰煞N蛋白酶對葡萄籽多肽的提取效果堿性蛋白酶優(yōu)于風味蛋白酶。因此，可用堿性蛋白酶制備葡萄籽多肽。

多肽具有蛋白質的構成和修補機體組織、提供熱量、參與體內物質的代謝調節(jié)、增強抵抗力、調節(jié)滲透壓和維持血的酸堿度等特性外，還具有許多特殊的作用。如多肽是傳遞信息的使者，能對各種各樣的生理活動和生化反應進行調節(jié);多肽的生物活性非常高;多肽的分子非常小，相對蛋白質而言，更容易進行人工化學合成［11］。本實驗表明葡萄籽多肽有很強的抗氧化能力和還原能力，還具有一定抑菌能力，此外葡萄籽多肽具有很好的乳化性和乳化穩(wěn)定性，為葡萄籽多肽的開發(fā)提供了理論基礎。

4 結論

根據兩種酶的最佳水解條件進行水解，結果表明，堿性蛋白酶優(yōu)于風味蛋白酶，堿性蛋白酶的最佳水解條件是pH值為11.5、酶用量為0.9%、水解時間為18h的條件下達到最大水解度46.16%。葡萄籽多肽有很強的清除DPPH·和H2O2的能力，有一定的清除O－2·和抑制脂質過氧化能力，總還原力隨濃度增加而增加。此外葡萄籽多肽對金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌1515、黑曲霉和青霉都有較強抑制作用，另外葡萄籽多肽還具有很好的乳化性和乳化穩(wěn)定性。因此，用堿性蛋白酶可制得水解度較高的葡萄籽多肽，該多肽中存在抗氧化肽、抑菌肽、表面活性肽。

［1］吉宏武.葡萄酒廠下腳料的綜合開發(fā)利用途徑［J］.食品研究與開發(fā)，2000（1)：29-31.

［2］刁小琴，張有林，關海寧.天然活性多肽及其應用前景［J］.糧食與脂，2006（5)：43.

［3］任其龍，魏冠紅，金米聰，等.反相高效液相色譜——電噴霧質譜法鑒定葡萄籽低聚原花青素［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006（3)：32.

［4］李銀平，薛雪萍，袁春龍，等.葡萄籽成分與營養(yǎng)評價［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（1)：108-110.

［5］劉軍，李進，曲鍵，等.葡萄皮渣的綜合利用［J］.中外葡萄與葡萄酒，2006（3)：51-53.

［6］方海紅，胡好遠，黃紅英.微生物堿性蛋白酶的研究進展［J］.微生物學通報，2002，29（2)：57-59.

［7］仵昱舟，馮翠萍.酶法提取葡萄籽中蛋白質工藝優(yōu)化［J］.食品科學，2010，31（2)：63-64.

［8］Ruberto G，Renda A，Dapuno C，et al.Polyphenol constituents and antioxidant activity of grape pomace extracts from five Sicilian red grape cultivars［J］.Food chemistry，2007，100（1)：203-210.

［9］丁紅秀，高蔭榆，晁紅娟，等.毛竹葉柄多糖體外抗氧化作用研究［J］.食品科學，2007，28（11)：122-124.

［10］Zhang E X，Yu L J.Studies on polysaccharide from Sargassum ThunbergⅡfor its ability to scavenge active oxygen species［J］.Chinese Journal of Marine Drugs，1997，3：1-4.

［11］劉玉德，曹雁平.生物蛋白肽的開發(fā)研究展望［J］.食品科學，2002，23（8)：319-340.

Preparation of Grape Seed Poly－peptide and Functional Research

YANG Bi-xia1，FENG Cui-ping2，ZHANG Shuo2，QI Hai-xin2
（1.CollegeofInformation，ShanxiAgriculturalUniversity，TaiguShanxi030800;2.CollegeofFoodScienceand Engineering，ShanxiAgriculturalUniversity，TaiguShanxi030801)

In the preparation of grape seed poly－peptide，flavor protease and alkaline protease were used，pH，enzyme dosage and time being the factors，using L9（33)orthogonal test to determine the best of the protease and hydrolysis conditions.The results showed that alkaline protease was superior to flavor protease.If pH was 11.5，the amount of enzyme was 0.9%，hydrolysis time was 18h，alkaline protease could reach the best hydrolysis condition，and the biggest degree of hydrolysis was 46.16%.Grape seed poly－peptide had a strong ability to clear DPPH·and H2O2，a certain ability to clear O－2·and inhibited the lipid peroxidation，the total reducing capacity was increased with the increase of concentration.Besides，grape seed poly－peptide had a strong inhibition effect onStaphylococcusaureus，Shigella，Bacillussubtilis，EscherichiaColi1515，AspergillusnigerandPenicillium，the inhibitory ability for each microbial bacterium was 70.77%，65.28%，59.07%，60.71%，60.71%and 50.86%.Besides，it had good emulsification and emulsion stability.The results also showed this poly－peptide contained antioxidant peptides，anti-microbial peptides and surfactant peptides.

Grape seeds;Poly－peptide;Protease;Biological activity

TQ914.3

A

1671-8151（2011)06-0551-06

2011-09-21

2011-10-25

楊碧霞（1981-)，女（漢)，山西新絳人，碩士，主要從事食品質量與安全方面的研究。

馮翠萍，博士，教授，碩士生導師。Tel：0354- 6288325;E-mail：ndfcp＠163.com。

（編輯：武英耀)