負(fù)載miR-138復(fù)制缺陷型腺病毒對(duì)hTERT表達(dá)的影響*

劉志鵬,王宗華,梁光萍,熊曉峰,范亞川,鄒利全,王洪斌,陳 陵,李學(xué)成△

(1.中國人民解放軍第三二四醫(yī)院消化內(nèi)科,重慶400020;2.第三軍醫(yī)大學(xué)護(hù)理學(xué)院,重慶400038;3.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院燒傷研究所,重慶400038)

端粒酶通過延長染色體末端端粒,維持細(xì)胞永生化能力。而人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)是端粒酶的限速成分,直接決定了端粒酶活性[1]。目前有關(guān)hTERT的調(diào)控機(jī)制尚未完全明確。有關(guān)hTERT表達(dá)調(diào)控的研究大多為轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié),未涉及轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)。但是轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)因子眾多,關(guān)系復(fù)雜,很難通過控制轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)有效控制hTERT的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)主要涉及微RNAs(miRNA)。miRNA是最大的一類基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子,極微量的miRNA即可對(duì)靶蛋白的表達(dá)產(chǎn)生有效的調(diào)控作用。研究hTERT在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控,對(duì)理解腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制,以及基于miRNA的腫瘤診斷與治療具有重要意義[2]。在前期工作中成功包裝了負(fù)載miR-138的腺病毒[3],在本研究中,進(jìn)一步研究基于腺病毒載體的miRNA表達(dá)調(diào)控效果,為基于miRNA的hTERT轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制的研究,以及基于hTERT調(diào)控相關(guān)miRNA的腫瘤診斷與治療研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清,高糖DM EM培養(yǎng)液、RPM I 1640培養(yǎng)液以及胰酶消化液(美國 HyClone公司);Trizol試劑(美國Invitrogen公司),焦碳酸二乙酯水(北京天根公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR試劑盒(日本TAKARA公司);MPERTM蛋白提取試劑(美國 Pierce公司);蛋白酶抑制劑(美國Sigma公司);BCA蛋白定量試劑盒(上海申能博彩公司);轉(zhuǎn)化有腺病毒E1區(qū)基因的包裝細(xì)胞 HEK293,本室保存。負(fù)載有miR-138表達(dá)序列的復(fù)制缺陷型腺病毒(Ad-miR138),由本室構(gòu)建并保存[3];負(fù)載有β-半乳糖苷酶(β-gal)基因 LacZ的復(fù)制缺陷型腺病毒,由西南醫(yī)院心內(nèi)科唐兵博士惠贈(zèng)。U6及miR-138特異 RT及 real-time PCR引物(廣州銳博公司);hTERT mRNA的real-time PCR引物由上海生工合成純化,其上游序列 P1:5′-CGG AAG AGT GTC TGG AGC AA-3′;下游序列 P2:5′-GGA TGA AGC GGA GTC TGG A-3′,擴(kuò) 增片段長度144 bp[4];ABI 7500熒光定量 PCR儀(美國 AB公司)。

1.2 方法

1.2.1 腺病毒感染BGC-823細(xì)胞 負(fù)載miR-138的復(fù)制缺陷型腺病毒(Ad-miR138)在前期工作中已純化、濃縮并已測(cè)定滴度[3]。將濃縮的腺病毒液取出后,按200∶1的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染BGC-823細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng) 72 h后,分別檢測(cè)miR-138、hTERT mRNA以及hTERT蛋白表達(dá)水平。以感染負(fù)載有β-半乳糖苷酶(β-gal)基因 LacZ的復(fù)制缺陷型腺病毒的BGC-823細(xì)胞作為陰性對(duì)照,未感染腺病毒的BGC-823細(xì)胞作為空白對(duì)照。

1.2.2 總RNA抽提 消化細(xì)胞后計(jì)數(shù),取107個(gè)細(xì)胞以200 g離心5 min,棄去上清后加 Trizol試劑1 mL,反復(fù)吹打。按照Trizol試劑說明書步驟提取總RNA,再將總RNA溶于DEPC水中,用紫外分光光度儀測(cè)定RNA濃度和純度。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)(real-time PCR) 以U6管家基因作為內(nèi)參,校正器參考文獻(xiàn)[5]方法,選用未感染病毒的空白對(duì)照組BGC-823細(xì)胞(ZERO)作為校正器,每個(gè)標(biāo)本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。取總RNA 100 ng為模板,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配20 μ L反應(yīng)體系,反應(yīng)條件為42℃15 min,85℃5 s;然后按照real-time PCR試劑盒說明書,取合成的cDNA 4 μ L為模板,配25μ L反應(yīng)體系,預(yù)變性95℃30 s,反應(yīng)40個(gè)循環(huán),條件為 95℃5 s,60℃34 s。采用2-△△Ct法進(jìn)行結(jié)果分析,將不同標(biāo)本的RQ值(RQ=2-△△Ct)進(jìn)行比較。△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參照基因Ct值,△△Ct=待測(cè)標(biāo)本的△Ct-校正器△Ct。

1.2.4 Western Blot實(shí)驗(yàn) 消化細(xì)胞后計(jì)數(shù),取107個(gè)細(xì)胞以200 g離心5 min,棄去上清后以M-PERTM蛋白提取液處理細(xì)胞,收集細(xì)胞總蛋白,BCA法定量后經(jīng)SDS-PAGE,電轉(zhuǎn)膜,免疫抗體反應(yīng),最后化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法(ECL)顯帶,具體步驟按文獻(xiàn)[6]操作,以GAPDH為內(nèi)參照。

2 結(jié) 果

2.1 real-time PCR檢測(cè)miR-138的表達(dá)豐度 熔解曲線顯示,U6與miR-138呈單峰,擴(kuò)增曲線呈S形,表明引物特異性好,real-time PCR結(jié)果可靠。

表1 miR-138、hTERT mRNA在各組細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)定量(±s)

表1 miR-138、hTERT mRNA在各組細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)定量(±s)

*:P＜0.05,與Ad-NC組比較。

BGC-823細(xì)胞分組miR-138相對(duì)表達(dá)定量hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)定量ZERO 1.085±0.478 1.02±0.34 Ad-NC 0.928±0.199 1.32±0.67 Ad-miR138 9.152±2.641* 0.91±0.35

圖1 Western Blot檢測(cè) BGC-823細(xì)胞內(nèi)hTERT蛋白的表達(dá)

2.2 real-time PCR檢測(cè)Ad-miR138感染后BGC-823細(xì)胞內(nèi)miR-138、hTERT mRNA表達(dá)豐度的改變 分析結(jié)果顯示,與感染陰性對(duì)照腺病毒的BGC-823細(xì)胞組(Ad-NC)相比,未感染腺病毒的空白對(duì)照組(ZERO)的BGC-823細(xì)胞內(nèi)miR-138的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而感染Ad-miR138腺病毒的BGC-823細(xì)胞(Ad-miR138)內(nèi)miR-138的表達(dá)豐度則顯著增加(P＜0.05)。3組 BGC-823細(xì)胞 hTERT mRNA的表達(dá)水平各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.3 Ad-miR138感染BGC-823細(xì)胞后hTERT蛋白表達(dá)的變化 結(jié)果顯示,BGC-823細(xì)胞感染負(fù)載miR-138的腺病毒AdmiR138后,hTERT蛋白的表達(dá)下調(diào),見圖1。

3 討 論

hTERT僅在腫瘤組織及極少部分正常組織中表達(dá),而絕大多數(shù)正常組織中無表達(dá)[7]。以hTERT為靶標(biāo)的抗腫瘤治療研究是當(dāng)前的一個(gè)重要策略[8]。本文前期工作發(fā)現(xiàn),將hTERT全長cDNA導(dǎo)入樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC),在體外[9]及裸鼠體內(nèi)[10]均可有效激發(fā)針對(duì)端粒酶的特異細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng),對(duì)多種端粒酶陽性的腫瘤細(xì)胞具有明顯的殺傷效果;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),將hTERT全長cDNA轉(zhuǎn)染至端粒酶陰性的骨肉瘤細(xì)胞系U-2 OS后,其增殖能力及侵襲能力增強(qiáng),提示hTERT不僅參與腫瘤的發(fā)生,而且還參與腫瘤的轉(zhuǎn)移過程[11]。因此在轉(zhuǎn)錄后水平抑制hT ERT蛋白表達(dá)的相關(guān)miRNA可作為潛在的腫瘤治療靶位。目前已發(fā)現(xiàn)miR-138可在轉(zhuǎn)錄后水平抑制hTERT表達(dá)。因此,通過上調(diào)miR-138表達(dá)豐度而抑制hTERT蛋白表達(dá)水平,有可能抑制腫瘤細(xì)胞端粒酶活性,進(jìn)而抑制腫瘤增生與轉(zhuǎn)移。人類基因組中至少存在數(shù)千條miRNA,是最大的一類轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子[12]。由于miRNA對(duì)包括腫瘤相關(guān)蛋白在內(nèi)的多種蛋白起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用,其表達(dá)譜的改變,在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用,有可能作為腫瘤早期診斷的治療靶標(biāo)[13-15]。目前存在3種方式對(duì)miRNA進(jìn)行安全而高效的調(diào)控。(1)人工合pre-miRNA的短核苷酸片段,采用轉(zhuǎn)染試劑將片段轉(zhuǎn)入細(xì)胞,在細(xì)胞內(nèi)Dicer酶作用下,形成成熟的miRNA片段而發(fā)揮功能。優(yōu)點(diǎn)是簡單易行,效果確實(shí),但不足之處是一次轉(zhuǎn)入短核苷酸片段后,不能持續(xù)高水平表達(dá)目的miRNA。并且由于要用到轉(zhuǎn)染試劑,無法在體內(nèi)進(jìn)行。(2)將pre-miRNA片段克隆至質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng),再轉(zhuǎn)染質(zhì)粒至細(xì)胞。這一方法優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)可持續(xù)較高水平表達(dá)目的miRNA,但還是只適合用于體外。(3)采用病毒載體方法,如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、慢病毒等。本文在研究中采用腺病毒載體系統(tǒng)。腺病毒載體系統(tǒng)可廣泛用于人類及非人類基因的表達(dá),在大多哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織中均可表達(dá)重組基因,并且腺病毒具有嗜上皮細(xì)胞性,而人類的大多數(shù)的腫瘤就是上皮細(xì)胞來源的,非常適于靶向腫瘤的基因治療載體[16]。另外,腺病毒的復(fù)制基因和致病基因均已相當(dāng)清楚,在人群中早已流行。人感染野生型腺病毒后僅產(chǎn)生輕微的自限性癥狀,且腺病毒則除了卵細(xì)胞以外幾乎在所有已知細(xì)胞中都不整合到染色體中,不會(huì)干擾其他的宿主基因。作者在前期研究中成功包裝負(fù)載miR-138前體(pre-miR-138)cDNA的腺病毒表達(dá)載體[3]。在本研究中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),利用腺病毒載體技術(shù)可有效上調(diào)腫瘤細(xì)胞內(nèi)miRNA的表達(dá)豐度,進(jìn)而有效抑制靶基因的表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)為基于hTERT調(diào)控相關(guān)miR-138的腫瘤免疫基因治療奠定了基礎(chǔ)。需進(jìn)一步深入研究的問題是,上調(diào)腫瘤組織內(nèi)hTERT調(diào)控相關(guān)miR-138表達(dá)豐度后,雖然可以抑制hTERT蛋白的表達(dá),但由于miRNA對(duì)靶基因是微調(diào)作用,無法完全封閉hTERT表達(dá),那么未被抑制的hTERT活性在多大程度與范圍內(nèi)是否可以繼續(xù)維持腫瘤細(xì)胞的生長與增殖,采用腺病毒負(fù)載的hT ERT調(diào)控相關(guān)miR-138是否能有效抑制hTERT陽性的腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移,這些問題有待進(jìn)一步探討。

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