銀杏葉提取物對(duì)大鼠重癥急性胰腺炎腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

何 彩,王 煊,鄧明明,周正端,劉 宏,屈小平

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,四川瀘州646000)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是臨床常見的危重癥之一,隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變,其發(fā)病率有所上升,死亡率居高不下。SAP并發(fā)腎臟損傷是SAP死亡率高的重要因素之一。目前有關(guān)炎癥介質(zhì)在SAP發(fā)病機(jī)制中的作用逐漸受到關(guān)注,但SAP腎損傷與炎癥介質(zhì)之間的關(guān)系尚未明了,因此本研究擬通過觀察Toll樣受體4/核因子κ B(toll-like receptor 4/nuclear factor kappa B,TLR4/NF-κ B)炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和腎臟功能及組織形態(tài)學(xué)變化,探討銀杏葉提取物對(duì)大鼠SAP腎損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康雌性Sprague-Dewley(SD)大鼠90只,體質(zhì)量200～240 g(購自瀘州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科);銀杏葉提取物(購自黑龍江省珍寶島制藥有限公司);?；悄懰徕c(購自Sigma公司);腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-1,IL-6)的ELISA試劑盒(均購自博士德公司);兔抗大鼠T LR4多克隆抗體(購自博澳森公司);小鼠抗大鼠NF-κ B多克隆抗體(購自Santa Cruz公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組和模型的復(fù)制 雌性SD大鼠90只,體質(zhì)量200～240 g,隨機(jī)分為假手術(shù)組(N組),重癥急性胰腺炎模型組(P組),銀杏葉提取物治療組(S組),每組 30只。P組和 S組采用5%牛磺膽酸鈉逆行胰膽管注射方法復(fù)制大鼠重癥急性胰腺炎模型,N組開腹后翻動(dòng)腸壁即關(guān)腹。術(shù)后禁食,清醒后自由進(jìn)水。S組大鼠在術(shù)后10 min給予銀杏葉提取物(6.25 mg/kg)尾靜脈注射;P組大鼠采用同樣方法給予等量的生理鹽水。于12、24、48 h時(shí)間點(diǎn)每組分別處死10只,光鏡下P組和S組各時(shí)間點(diǎn)均選擇6只造模成功的大鼠進(jìn)入檢測,以光鏡下胰腺組織壞死、出血為造模成功。

1.2.2 腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察和病理學(xué)評(píng)分 常規(guī)HE染色并觀察,以改良的 Rabb等[1]和 Solez等[2]法,對(duì)腎臟損傷進(jìn)行評(píng)分。

1.2.3 尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和肌酐(crea,Cr)的測定 用全自動(dòng)生化分析儀檢測。

1.2.4 TNF-α和IL-6的測定 大鼠血清 TNF-α和 IL-6的測定均使用ELISA法,按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 腎臟組織中的TLR4和NF-κ B的表達(dá) 均采用腎臟石蠟組織塊行免疫組織化學(xué)法(SABC法)測定。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各組數(shù)據(jù)均以±s表示,結(jié)果用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。多樣本均數(shù)比較采用方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察和病理學(xué)評(píng)分 常規(guī)HE染色光鏡下N組各時(shí)間點(diǎn)大鼠腎臟組織未見異常。隨時(shí)間延長,P組腎小球淤血,腎小管上皮細(xì)胞腫脹,間質(zhì)水腫及炎細(xì)胞浸潤逐漸加重。S組和P組相比,12 h時(shí)間點(diǎn)大鼠腎臟組織改變無明顯差異;24 h和48 h時(shí)間點(diǎn)有所減輕。腎臟組織病理學(xué)評(píng)分示:各時(shí)間點(diǎn)P組較N組明顯增高(P＜0.05),S組與P組比較,評(píng)分降低,但12 h時(shí)間點(diǎn)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),24 h和48 h時(shí)間點(diǎn)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見表 1。

2.2 血清BUN和Cr的變化 BUN和Cr在P組和S組大鼠血中的濃度呈逐漸增高趨勢。其中12 h時(shí)間點(diǎn)比較,P組高于N組(P＜0.05),S組與P組無明顯差異(P＞0.05);24 h和48 h時(shí)間點(diǎn)比較,P組均高于N組(P＜0.05),S組均低于P組(P＜0.05),見表2。

2.3 血清 TNF-α和 IL-6的變化 造模后大鼠血清TNF-α和IL-6隨著時(shí)間的延長而逐漸升高。P組各時(shí)間點(diǎn)TNF-α和IL-6的濃度較N組均明顯增高(P＜0.05),S組的濃度較P組均明顯降低(P＜0.05),見表 3。

表1 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)評(píng)分的變化(±s,n=6)

表1 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)評(píng)分的變化(±s,n=6)

*:P＜0.05,與N組比較;▲:P＜0.05,●:P＞0.05,與P組比較。

組別 12 h 24 h 48 h N 組 0.67±0.52 0.83±0.41 1.00±0.63 P組 5.17±0.75* 9.50±1.05* 12.00±0.89*S組 4.67±0.82● 7.83±0.75▲ 9.33±0.82▲

2.4 腎臟組織中TLR4和NF-κ B的蛋白表達(dá)變化 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腎臟組織中T LR4和NF-κ B蛋白陽性表達(dá)呈棕黃色,主要定位于腎小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi),N組幾乎無表達(dá),在P組和S組隨時(shí)間延長陽性產(chǎn)物的密度和染色深度增強(qiáng)。其中各時(shí)間點(diǎn)P組T LR4和NF-κ B蛋白陽性表達(dá)高于N組(P＜0.05),S組的表達(dá)有所降低,低于P組(P＜0.05),見封 3圖 1、2,封 4圖 3～ 6,表 4。

表2 各組大鼠血清BUN和Cr的變化(±s,n=6)

表2 各組大鼠血清BUN和Cr的變化(±s,n=6)

*:P＜0.05,與N 組比較;▲:P＜0.05,●:P＞0.05,與P組比較。

組別BUN(mmol/L)12 h 24 h 48 h Cr(μ mol/L)12 h 24 h 48 h N 組 6.54±0.71 6.58±0.48 6.95±0.89 35.30±4.77 36.72±6.55 37.32±6.17 P組 8.76±0.77* 15.05±2.07* 23.04±6.30* 69.27±5.29* 103.60±11.22* 182.08±24.35*S組 8.32±0.64● 11.04±1.57▲ 16.15±1.41▲ 64.67±3.46● 77.12±9.57▲ 136.12±11.82▲

表3 各組大鼠血清TNF-α和IL-6的變化(±s,n=6)

表3 各組大鼠血清TNF-α和IL-6的變化(±s,n=6)

*:P＜0.05,與N組比較;▲:P＜0.05,與P組比較。

組別T NF-α(pg/mL)12 h 24 h 48 h IL-6(pg/mL)12 h 24 h 48 h N 組 21.25±2.75 22.30±4.00 24.22±3.80 44.91±4.14 46.49±5.17 47.90±5.34 P組 52.91±6.55* 82.63±6.15* 103.65±9.96* 103.76±10.25* 140.39±11.28* 164.24±10.88*S組 40.50±6.61▲ 66.70±4.69▲ 89.46±6.20▲ 77.31±8.69▲ 119.49±9.66▲ 138.26±12.51▲

表4 各組大鼠腎臟組織 TLR4和 NF-κ B的積光分密度(IOD)平均值的變化(±s,n=6)

表4 各組大鼠腎臟組織 TLR4和 NF-κ B的積光分密度(IOD)平均值的變化(±s,n=6)

*:P＜0.05,與N組比較;▲:P＜0.05,與P組比較。

組別T LR4 12 h 24 h 48 h NF-κ B 12 h 24 h 48 h N 組 7.21±0.92 7.44±0.69 7.59±1.08 7.65±0.89 7.76±0.65 7.91±0.87 P組 24.56±3.68* 38.84±4.10* 54.35±5.34* 28.76±5.15* 42.71±5.35* 53.05±5.07*S組 18.42±3.25▲ 29.20±4.76▲ 40.50±5.41▲ 22.51±3.35▲ 34.20±5.39▲ 43.79±4.74▲

3 討 論

TLR4是T LRs家族中介導(dǎo)內(nèi)毒素/脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)應(yīng)答的最重要受體,作為機(jī)體炎性反應(yīng)鏈的啟動(dòng)蛋白,它通過對(duì)病原相關(guān)分子模式中的特有抗原成分進(jìn)行信號(hào)識(shí)別、轉(zhuǎn)導(dǎo),而 LPS作為 TLR4最重要的配體,與 TLR4/NF-κ B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)系密不可分。其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要包括髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor,MyD88)依賴和MyD88非依賴通路,NF-κ B是通路中的一個(gè)至關(guān)重要的點(diǎn)。其中最重要的MyD88依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要介導(dǎo)NF-κ B的活化和炎癥細(xì)胞因子 TNF-α和 IL-6等的產(chǎn)生[3-8]。正常情況下,TLR4在腎臟組織的表達(dá)很弱,病理狀態(tài)下,表達(dá)增強(qiáng)[9-10]。在本實(shí)驗(yàn)中,P組大鼠腎臟組織的T LR4、NF-κ B蛋白表達(dá)都較N組明顯上調(diào),P組大鼠血清 BUN、Cr、TNF-α、IL-6較N組增高,腎臟組織病理學(xué)評(píng)分也高于N組,表明SAP腎損傷與TLR4、NF-κ B的異常表達(dá)相關(guān)。其機(jī)制可能是由于SAP早期的腸源性細(xì)菌移位,腸道感染中的細(xì)菌多以革蘭陰性菌為主,其細(xì)胞壁中的 LPS與腎臟組織中的TLR4結(jié)合,TLR4表達(dá)增強(qiáng),引發(fā)一系列的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),使得 TLR4/NF-κ B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活,其下游炎癥介質(zhì) TNF-α、IL-6等釋放而損傷腎臟組織,致使腎功能受損。實(shí)驗(yàn)表明,TLR4可能在SAP腎損傷中起著重要的作用,擔(dān)當(dāng)著炎癥反應(yīng)途徑的“閥門”。

有學(xué)者對(duì)大承氣湯治療SAP大鼠的實(shí)驗(yàn)研究表明其可能通過減少致炎因子或增加抑炎因子來影響SAP的炎性反應(yīng)[11]。目前對(duì)藥用植物銀杏之銀杏葉提取物用于治療SAP研究較少,銀杏葉提取物在我國取材方便,應(yīng)用廣泛,不良反應(yīng)少。銀杏葉提取物的主要成分包括銀杏葉黃酮苷、銀杏葉內(nèi)酯和銀杏新內(nèi)酯等?，F(xiàn)代藥理研究表明:銀杏葉提取物具有抗氧化、清除自由基、改善微循環(huán)、提高神經(jīng)可塑性等作用[12-13]。銀杏葉提取物中含有的銀杏內(nèi)酯被認(rèn)為是PAF受體的特異性拮抗劑,可降低血液黏滯度,抑制血小板功能,改善微循環(huán)[14]。有學(xué)者研究銀杏葉提取物對(duì)早期糖尿病患者氧化應(yīng)激的影響,發(fā)現(xiàn)經(jīng)銀杏葉提取物治療后的糖尿病患者血清丙二醛下降,超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶升高,提示銀杏葉提取物可能通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),對(duì)早期糖尿病腎病患者起到腎臟保護(hù)作用[15]。楊珍[16]通過對(duì)生長抑素聯(lián)合銀杏葉提取物注射液治療急性胰腺炎的臨床研究提示:舒血寧可改善胰腺血液循環(huán),增加器官血液灌流,改善缺血,預(yù)防血栓形成,防治胰腺缺血、壞死,減少胰源性物質(zhì)損傷腎臟。本實(shí)驗(yàn)顯示,與P組大鼠比較,經(jīng)銀杏葉提取物治療的S組大鼠其腎損傷無論在大體形態(tài)上,還是腎組織病理評(píng)分方面,程度都明顯減輕,血清中BUN和Cr濃度也低于P組,表明銀杏葉提取物對(duì)大鼠SAP腎損傷具有保護(hù)作用。而銀杏葉提取物是否能抑制 TLR4/NF-κ B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生是實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)之一。

實(shí)驗(yàn)中銀杏葉提取物治療后的S組與P組相比,大鼠腎臟組織的T LR4、NF-κ B蛋白表達(dá)降低,血清中 TNF-α、IL-6不同程度的降低,說明銀杏葉提取物能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答,達(dá)到保護(hù)機(jī)體的作用。推測其機(jī)制:銀杏葉提取物可能減少了LPS與脂多糖結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)及CD14形成復(fù)合物,復(fù)合物與T LR4的結(jié)合減少,從源頭抑制了 T LR4/NF-κ B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中 T LR4的活化,也可能抑制T LR4/NF-κ B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的 TLR4和NF-κ B兩個(gè)關(guān)鍵因子的活化,阻斷了TLR4/NF-κ B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中下游炎癥介質(zhì)釋放,從而減輕了炎癥介質(zhì)對(duì)組織的損傷,最終發(fā)揮對(duì)SAP腎損傷的保護(hù)作用[17-19]。

目前國內(nèi)外報(bào)道銀杏葉提取物用于治療SAP腎損傷的研究很少,對(duì)銀杏葉提取物是否可抑制 TLR4/NF-κ B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中,大鼠SAP腎損傷時(shí),應(yīng)用銀杏葉提取物治療后,腎臟組織中的 TLR4和 NF-κ B蛋白表達(dá)減弱,從而減少了炎癥介質(zhì) TNF-α、IL-6等的釋放,TNF-α和IL-6釋放減少,也可能反向減低了 NF-κ B的活化[20],并且隨著炎癥介質(zhì)的減少和微循環(huán)的改善,腸源性細(xì)菌移位和內(nèi)毒素血癥得到緩解,LPS與TLR4的結(jié)合受到抑制,“環(huán)式”炎癥網(wǎng)絡(luò)得到有效控制,達(dá)到治療SAP腎損傷的作用[21]。說明銀杏葉提取物有較好的臨床應(yīng)用前景,可能為臨床急性胰腺炎腎損傷的治療提供新的途徑。

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