醋柳黃酮對高血壓大鼠主動脈環(huán)舒縮反應(yīng)的影響及機制

高天林,余 琴,劉應(yīng)才,蔣 毅,謝雪梅

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科,四川瀘州646000)

醋柳黃酮(total flavones of hippophae rhamnoides L,TFH)是一種從野生胡頹子科植物醋柳(俗稱沙棘)的果實中提取出的一種有效成分。TFH含有7種單體成分,其中以槲皮素(quercetin,Que)及異鼠李素(isorhamnetin,Iso)含量較高。TFH具有重要的心血管保護作用,包括抗氧化、擴血管、降壓、抗凝、抑制心肌肥厚和保護內(nèi)皮功能等[1]。血管內(nèi)皮細胞可合成和分泌一氧化氮(NO),NO具有強有力的擴張血管、降低血壓、抑制血小板黏附和聚集等作用,是已知的具有抗高血壓作用的保護性因子。本實驗用TFH灌胃治療腹主動脈縮窄高血壓大鼠6周,觀察大鼠離體主動脈環(huán)對血管活性藥物的舒縮反應(yīng),并檢測血清NO濃度的變化,旨在探討醋柳黃酮?的舒張血管作用及其機制和NO的關(guān)系,為選擇黃酮類藥物在高血壓防治中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器 TFH(商品名:心達康片)購自四川美大康藥業(yè)股份有限公司(國藥準字 Z51020089,批號 100101),卡托普利(CP)購自汕頭金石制藥總廠(國藥準字H44024904,批號100403),乙酰膽堿(Ach)、Krebs液所用試劑均購自Sigma公司,左旋硝基精氨酸甲酯(L-NANE)購自碧云天生物技術(shù)研究所,重酒石酸去甲腎上腺素(NE)購自武漢遠大制藥集團有限公司(國藥準字 H42021301,批號 090201),一氧化氮試劑盒購自南京建成生物工程研究所,Krebs溶液成分為NaCl 127 mmol/L,KCl 5.9 mmol/L,MgCl21.2 mmol/L,NaH2PO40.25 mmol/L,CaCl22.4 mmol/L,HEPES 10.0 mmol/L,Glucose 12.0 mmol/L,pH為7.4,實驗時臨時配制。Powerlab生理實驗系統(tǒng),規(guī)格型號Powe-lab/8sp,購自澳大利亞 Powerlab公司,M LT0202高靈敏張力傳感器,購自AD Instruments公司,HSS-1型恒溫浴槽,購自成都儀器廠。

1.2 動物模型的制備 取健康Wistar大鼠55只,雄性,體質(zhì)量180～200 g,由瀘州醫(yī)學(xué)院動物中心提供。隨機分為腹主動脈縮窄手術(shù)組45只和假手術(shù)組10只。參照文獻并對手術(shù)方式加以改進,用1%巴比妥鈉0.5 mL/100 g腹腔注射麻醉后,于左肋弓下緣0.5 cm、脊柱前0.5 cm處行 1.5～2.0 cm縱切口,逐層分離皮下組織,在左右腎動脈分支之間的腹主動脈下方穿入2.0手術(shù)縫線,沿血管走行方向放置針尖磨鈍的7號注射針頭,與腹主動脈一起結(jié)扎后小心拔出針頭,腹腔滴入青霉素(40萬U/mL)適量,逐層關(guān)腹,縫合。術(shù)后腹腔注射青霉素10萬U/mL,連續(xù)3 d。假手術(shù)組不結(jié)扎腹主動脈,其余同手術(shù)組。術(shù)后正常飲食,定時觀察體征。建模7 d后(45只),腹主動脈縮窄手術(shù)組隨機抽取5只采用頸動脈插管術(shù),利用Powerlab測量頸動脈血壓,血壓均大于150 mm Hg,建模成功。

1.3 實驗動物分組 腹主動脈縮窄手術(shù)組剩余40只隨機分為 4組,每組10只;即模型組、TFH 組、CP 組、TFH+CP組。假手術(shù)組、模型組每日用飲用水 10 mL/kg灌胃。TFH組用TFH 30 mg/kg;CP組用CP 100 mg/kg;TFH+CP組用 TFH 20 mg/kg和CP 60 mg/kg,將上述藥物溶解于飲用水中,按10 mL/kg每日1次胃管灌入,共6周。

1.4 方法

1.4.1 血漿NO的檢測 大鼠麻醉后,剪開胸部,心臟采靜脈血6 mL,高速離心后分離出血清,-20℃保存待用。應(yīng)用硝酸還原酶法,采用南京建成生物研究所提供的NO檢測試劑盒,嚴格按照說明書要求操作。

1.4.2 血管環(huán)制備及灌流 采血完畢,迅速剪下右腎動脈以上的胸主動脈,置于通以混合氣體(95%O2+5%CO2)的Krebs溶液中,小心去除周圍結(jié)締組織后將血管剪成4～5 mm寬的血管環(huán)。血管環(huán)插入兩根直徑200 μ m銀絲做成的等腰三角形支架,其底邊與血管環(huán)等長,其頂角穿入絲線結(jié)扎,移入10 mL盛有Krebs液的37℃恒溫浴槽,浴槽中持續(xù)充入混合氣體。絲線一端固定于浴槽底部,一端連于張力傳感器,傳感器與放大裝置相連,然后將信息輸入電腦。操作過程中避免過度牽拉,以保護內(nèi)皮的完整。用NE 10-6mol/L檢測離體胸主動脈環(huán)的活性,選擇經(jīng)NE 10-6mol/L處理后收縮的離體胸主動脈環(huán),靜息負荷為2 g,平衡90 min,平衡期間每30 min更換Krebs液1次。

1.4.3 實驗方法 每次實驗前,均預(yù)先用40 mmol/L KCl孵育最大收縮達平臺后,用Krebs液進行洗脫6次。觀察各組血管環(huán):在次最大收縮劑量(10-5mol/L)的NE預(yù)收縮最大張力達平臺后,檢測對Ach(3×10-7～3×10-4mol/L)累積濃度的內(nèi)皮依賴性舒張作用,以NE 10-5mol/L預(yù)收縮最大收縮幅度為100%,加入不同濃度Ach后的血管張力幅度與NE誘發(fā)最大收縮幅度之間的百分比反映內(nèi)皮依賴性舒張的變化;LNAM E(10-4mol/L)孵育 30 min后,再用 NE 10-5mol/L預(yù)收縮血管達穩(wěn)態(tài)后,檢測對 Ach(3×10-7～3×10-4mol/L)累積濃度的內(nèi)皮依賴性舒張作用的影響;分別測定不同濃度NE(10-7～10-4mol/L)時血管的收縮改變,誘導(dǎo)動脈環(huán)收縮反應(yīng)的程度表示為40 mmol/L KCl最大收縮反應(yīng)的百分比。

2 結(jié) 果

2.1 對大鼠血清NO濃度的影響 各組分別灌胃飼養(yǎng)6周后,模型組血清NO的濃度顯著低于假手術(shù)組(P＜0.05)。三組用藥組(TFH 組、CP組、TFH+CP組)與模型組比較,血清NO的濃度均顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。TFH組、CP組與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),TFH+CP組與假手術(shù)組比較血清NO濃度顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。三組用藥組之間比較,TFH組較CP組血清NO濃度顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),與TFH+CP組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);TFH+CP組與CP組比較血清 NO濃度顯著升高(P＜0.01),見表1。

表1 各組大鼠血清NO濃度比較(±s,n=10)

表1 各組大鼠血清NO濃度比較(±s,n=10)

a:P＜0.05,與模型組比較;b:P＞0.05,c:P＜0.05,與假手術(shù)組比較;d:P＜0.05,e:P＞0.05,與TFH 組比較;f:P＜0.01,與CP組比較。

組別 NO(μ mol/L)假手術(shù)組 43.06±10.36a模型組 15.28±9.25 T FH 組 62.50±28.47ab CP組 37.78±10.42abd T FH+CP組 71.76±20.22acef

2.2 對胸主動脈舒張功能的影響 NE預(yù)收縮后,大鼠胸主動脈對低、高濃度的Ach誘發(fā)的舒張反應(yīng),模型組與假手術(shù)組比較顯示舒張率顯著下降(P＜0.05),最大舒張百分率較假手術(shù)組顯著下降[(35.08±21.59)%∶(63.04±8.63)%,P＜0.01]。TFH組、CP組、TFH+CP組均能不同程度改善高血壓大鼠胸主動脈對低、高濃度的Ach誘發(fā)的舒張反應(yīng),與模型組比較舒張率有顯著升高(P＜0.05)[最大舒張百分率分別為(67.24±17.55)%、(68.52±6.74)%、(75.64±14.62)%和(42.24±14.59)%]。三組用藥組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05),見圖 1。

圖1 各組大鼠胸主動脈對Ach誘導(dǎo)的舒張反應(yīng)(%)

2.3 對L-NAME預(yù)處理的胸主動脈舒張功能的影響 經(jīng)LNAM E預(yù)處理后,大鼠胸主動脈對低、高濃度的Ach誘發(fā)的舒張反應(yīng),模型組較假手術(shù)組均顯示舒張率顯著下降(P＜0.05),最大舒張百分率顯著低于假手術(shù)組[(5.64±3.06)%∶(20.42±15.34)%,P＜0.05]。TFH 組、CP組、TFH+CP組對不同濃度的Ach誘發(fā)的舒張反應(yīng)均顯示不同程度下降,其中TFH+CP組與模型組比較下降幅度最小(P＜0.05),最大舒張百分率顯著高于模型組[(17.48±2.73)%∶(5.64±3.05)%,P＜0.05]。三組用藥組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),見圖 2。

圖2 各組經(jīng)L-NAME預(yù)處理的大鼠胸主動脈對Ach誘導(dǎo)的舒張反應(yīng)(%)

2.4 對胸主動脈收縮功能的影響 模型組大鼠胸主動脈對低、高濃度的NE的收縮敏感性顯著高于其他各組,其最大收縮百分率較假手術(shù)組顯著升高[(92.02±2.75)%∶(78.46±16.15)%,P＜0.05]。TFH 組、CP組、TFH+CP組對不同濃度的NE的收縮敏感性均不同程度降低,TFH組與模型組比較,在NE較低濃度(10-7～10-5mol/L)時,收縮敏感性顯著降低(P＜0.05)。CP組與模型組比較,在 NE較低濃度(10-7～10-6mol/L)時,收縮敏感性顯著降低(P＜0.05)。TFH+CP組對低、高濃度的NE的收縮敏感性顯著低于模型組,其最大收縮百分率與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義[(76.26±12.40)%∶(92.02±2.75)%,P＜0.05]。三組用藥組之間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05),見圖3。

圖3 各組大鼠胸主動脈對NE的收縮反應(yīng)(%)

3 討 論

1936年Szent-Gyorgyi首次對植物黃酮的有效成分槲皮素(Que)進行了分離鑒定,20世紀70年代華西醫(yī)科大學(xué)藥物研究所從野生胡頹子科植物醋柳(俗稱沙棘)的果實中提取出一種有效成分TFH。目前,從沙棘中提取的TFH已廣泛應(yīng)用于冠心病和高血壓的治療,取得了較好的療效,但是其降壓機制并不很明確。

本實驗采用的腹主動脈縮窄高血壓大鼠模型是篩選降壓藥常用的動物模型。早期由于腹主動脈縮窄引起機械性血管阻力增加,后期由于縮窄引起腎血流減少,導(dǎo)致腎臟灌注不足,激活體內(nèi)的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS),引起血壓升高。本實驗復(fù)制動物模型后,隨機抽樣血壓均大于150 mm Hg,建模成功。

實驗觀察到,模型組大鼠胸主動脈環(huán)存在舒縮功能的異常,其胸主動脈環(huán)對Ach誘發(fā)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)比其他各組明顯減弱,TFH組、CP組、TFH+CP組均能不同程度改善大鼠胸主動脈環(huán)對Ach誘發(fā)的內(nèi)皮依賴性舒張,與模型組比較舒張率顯著升高(P＜0.05)。說明模型組高血壓大鼠可能存在血管內(nèi)皮功能障礙,而TFH和CP對血管內(nèi)皮有保護作用。經(jīng)NO合成酶抑制劑L-NAME預(yù)處理的模型組大鼠胸主動脈環(huán)對不同濃度的Ach誘發(fā)的舒張反應(yīng)均顯示舒張率下降,與假手術(shù)組和 TFH+CP組比較舒張率顯著下降(P＜0.05)。進一步說明了模型組高血壓大鼠可能存在血管內(nèi)皮功能障礙,而TFH和CP對血管內(nèi)皮有協(xié)同保護作用,其擴血管作用與NO有關(guān)。

眾所周知,內(nèi)皮細胞依賴舒張活性降低及內(nèi)皮依賴收縮作用增加等內(nèi)皮細胞功能紊亂,與高血壓發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。因此保護內(nèi)皮細胞、增加血NO的水平,是治療高血壓的重要途徑之一。國外文獻表明,黃酮類表現(xiàn)內(nèi)皮依賴性血管擴張作用,當(dāng)內(nèi)皮去除時降低了其舒張反應(yīng)的敏感性而沒有影響最大舒張反應(yīng)[2];而Que經(jīng)葡萄苷酸化或硫酸化的代謝產(chǎn)物沒有直接的血管舒張作用[3]。Que和Iso可以通過抑制NADPH氧化酶介導(dǎo)的超氧陰離子的產(chǎn)生、減少p47的過度表達和增強內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性,使NO生物學(xué)活性提高,從而防止血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的內(nèi)皮損害和發(fā)揮抗高血壓的作用[4-5]。此外,Que可抑制氧化物在細胞內(nèi)的蓄積及細胞核內(nèi)磷酸化p53蛋白的轉(zhuǎn)活,從而降低因氧化誘導(dǎo)引起的內(nèi)皮細胞凋亡[6]。Iso可抑制氧化型低密度脂蛋白損傷引起的凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體1和Caspase23 mRNA表達上調(diào),以及通過p38MAPK途徑在轉(zhuǎn)錄水平影響內(nèi)皮細胞功能相關(guān)蛋白,如eNOS的表達,最終增加 NO 釋放[7-8]。Roghani等[9]應(yīng)用血管環(huán)技術(shù)研究Que對鏈唑霉素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血管舒張的影響,表明Que可以舒張血管,且有內(nèi)皮依賴性,可能通過NO及前列腺素介導(dǎo)的途徑。在本實驗中給腹主動脈縮窄大鼠長期服用TFH能明顯提高血管對Ach的舒張反應(yīng),實驗結(jié)果與Ajay等[10]的研究結(jié)果相似。以上說明黃酮類藥物可以保護血管內(nèi)皮細胞、刺激內(nèi)皮源性NO增加而舒張血管。為了進一步證明此機制,本實驗還通過直接檢測大鼠血清NO的濃度變化,觀察到 TFH用藥組(TFH組和 TFH+CP組)的血清NO濃度較模型組顯著升高(P＜0.01),且較CP組升高更明顯(P＜0.05)。國內(nèi)的臨床研究[11]也表明 TFH具有改善高血壓患者一氧化氮、內(nèi)皮素合成,糾正內(nèi)皮功能不良的作用。有文獻報道了TFH對大鼠離體胸主動脈環(huán)的舒張作用及其與內(nèi)皮的關(guān)系[12-13],發(fā)現(xiàn)THF呈劑量依賴性擴血管作用,其舒張血管的機制與內(nèi)皮NO有關(guān)。

另外,實驗觀察到,對NE誘發(fā)的收縮反應(yīng),模型組大鼠胸主動脈環(huán)的收縮敏感性顯著高于其他各組(P＜0.05),TFH組、CP組、TFH+CP組對不同濃度的NE的收縮敏感性均不同程度降低。說明模型組高血壓大鼠對交感神經(jīng)末梢釋放的NE,其收縮敏感性升高,而TFH和CP對交感神經(jīng)興奮引起的血管收縮有抑制作用,且有協(xié)同降壓作用,它們的作用機制除了保護內(nèi)皮細胞,增加血NO水平外,還可能與對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的抑制作用有關(guān)。

TFH及其單體Que、Iso對血漿及培養(yǎng)的主動脈平滑肌細胞(ASMCs)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)活性有抑制作用[14-16],可以改善胰島素敏感性和阻斷AngⅡ信號傳導(dǎo)通路[17],另外Que可以增加尿的排出量、促進尿鈉排出、降低醛固酮和血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1a)mRNA水平[18]。因此它們確有降壓及保護靶器官的作用。Edwards等[19]研究表明Que治療高血壓具有可靠的安全性和良好的應(yīng)用前景。常彬賓等[20]采用Meta分析,系統(tǒng)評價了TFH治療原發(fā)性高血壓的有效性、安全性和成本效果,表明TFH能有效降低收縮壓和舒張壓,對心臟和腎臟有保護作用,不良反應(yīng)較少,而且經(jīng)濟學(xué)效果較好。綜上所述,TFH及其單體有確切的降壓效果,長期服用可以改善高血壓大鼠血管內(nèi)皮舒張功能,降低血管對縮血管物質(zhì)的敏感性,其機制與保護血管內(nèi)皮、刺激內(nèi)皮源性NO增加,以及抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶有關(guān)。TFH的舒血管作用與卡托普利等效,兩藥聯(lián)用具有協(xié)同作用,能更理想的控制血壓。

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