貴州省新發(fā)現(xiàn)HIV-1毒株亞型特征研究*

孫顯光,何 翔,李志堅,張信輝,申莉梅

(1.貴州省CDC艾滋病性病皮膚病防治研究所艾滋病二科,貴陽550002;2.中國CDC艾滋病艾滋病預(yù)防控制中心病毒免疫室,北京100050)

艾滋病病毒為了適應(yīng)新的環(huán)境,必然通過變異或重組方式改變其屬性來求得生存[1-2]。艾滋病病毒亦稱人類免疫缺陷病毒,簡稱HIV,屬RNA逆轉(zhuǎn)錄酶病毒,具有高度的遺傳變異性,容易通過基因重組方式產(chǎn)生新的毒株或亞型。HIV分HIV-1、HIV-2兩個型別,我國以 HIV-1流行為主。目前全球HIV-1共發(fā)現(xiàn)14種亞型,我國31個省發(fā)現(xiàn)9種亞型[3],其中本省發(fā)現(xiàn)7種。隨著HIV-1在本省流行時間的延長,其亞型內(nèi)的變異也會越來越大。研究HIV毒株的基因亞型特征,具有重要的現(xiàn)場實用性,有助于從分子流行病學(xué)角度掌控HIV的流行狀況、制定預(yù)防干預(yù)措施以及疫苗的研制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 安順地區(qū)采樣41份,全為吸毒傳播樣本;貴陽、黔東南兩地區(qū)采樣19份,全為性傳播樣本;銅仁、六盤水、黔南3個地區(qū)采樣68份,包括血液傳播樣本29份、吸毒傳播樣本26份、性傳播樣本13份。病例對象全部為2007年新發(fā)現(xiàn)的HIV感染者并簽訂知情同意書。對照病毒株采用國際標準亞型參考株。

1.2 核酸提取 采用 Qiangen公司的 QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒,按說明書操作。

1.3 基因擴增與測序分析

1.3.1 引物 用中國疾病預(yù)防控制中心合成的NP21和NP22引物對為外側(cè)引物(ACA GTR CAR TGY ACA CAT GG,CAC TTC TCC AAT TGT CCI TCA);Env-C和Env-D3引物對為內(nèi)側(cè)引物(CTG TTI AAT GGC AGI CTA GC,RAT GGG AGG RGY ATA CAT)。

1.3.2 方法 按Nested基因擴增方法(PCR)進行。即:用5μL核酸樣品與 NP21/NP22初次擴增,95℃1 min;94℃30 s,56℃1 min,72℃2 min,30個循環(huán);72℃10 min。取1/10的反應(yīng)產(chǎn)物再與Env-C、Env-G做第2次擴增,95℃1 min;94℃20 s,54℃1 min,72℃1.5 min,30個循環(huán);72℃10 min。

1.3.3 PCR產(chǎn)物純化 采用Qiangen公司的Qiaex試劑盒,按說明書提純 HIV基因片斷,回收 DNA溶于 10 mmol/L Tris-HCl,pH8.7,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后與標準品對照計算核酸濃度。

1.3.4 核酸序列測定 1 μ g樣品與6 pmol/L引物經(jīng)測序反應(yīng)提純后,在 ABI公司3100A型DNA測序儀上進行序列測定。

1.3.5 序列分析 采用目前國際通用的基因序列分析方法。即:所測序列經(jīng)DNA軟件編輯后用GCG軟件包進行分析。以Pileup程序進行排序并與國際標準序列進行比較,以Pretly程序計算共享序列,用Distance程序測定毒株間序列離散率,用Growtree程序做系統(tǒng)樹狀分析。

1.3.6 HIV-1毒株亞型的判定 利用計算機軟件模型將樣本基因序列與國際標準參考株基因序列進行比對、構(gòu)建系統(tǒng)進化樹、確定HIV毒株亞型是目前國際公認的基因序列分析方法。用此法分析獲得gag和env基因區(qū)序列,分別確定不同基因的亞型;對于新發(fā)現(xiàn)的重組模式的序列進行重組斷點分析,結(jié)合2個基因片段的結(jié)果最終確定樣本亞型[4-5]。

3.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17進行統(tǒng)計分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1貴州省HIV-1毒株亞型分布結(jié)果 此次研究共發(fā)現(xiàn)4種HIV-1亞型毒株,其中CRF01-AE為貴州省首次發(fā)現(xiàn),且占檢出毒株的52.1%(62/119),是本次研究發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢流行毒株,見表1。

表1 119例HIV-1樣本亞型分布

2.2 貴州省HIV-1亞型毒株系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果 119例HIV-1亞型毒株經(jīng)gag基因和env基因系統(tǒng)進化樹分析,結(jié)果CRF01-AE的gag基因與國際標準株相近度達100%,其env基因與國際標準株相近度達96%,CRF07-BC的gag基因與國際標準株相近度達100%,其env基因與國際標準株相近度達98%,見圖 1、2。

2.3 貴州省HIV-1流行毒株組內(nèi)基因距離分布情況 此次研究結(jié)果01-AE基因離散率遠比07-BC基因離散率小,表明01-AE亞型毒株在貴州的流行時間較短,見表2。

表2 119例HIV-1流行毒株組內(nèi)基因距離分布

2.4 貴州省HIV-1各亞型毒株在不同人群中的分布 用不同地區(qū)測序成功病例數(shù)與各亞型所占比例數(shù)進行統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)它們之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),見表3。

表3 119例HIV-1亞型毒株在不同地區(qū)及傳播人群中的分布

圖1 貴州省HIV-1毒株env基因系統(tǒng)進化樹分析

圖2 貴州省HIV-1毒株gag基因系統(tǒng)進化樹分析

3 討 論

3.1 亞型毒株分布特征 本次研究通過HIV-1毒株外膜蛋白擴增和基因序列測定分析,貴州省119份樣本有CRF01-AE、CRF07-BC、B、CRF08-BC 4種亞型,以CRF01-AE 重組亞型為主要流行株,CRF07-BC次之。其中,CRF01-AE亞型毒株主要從銅仁、安順地區(qū)的樣本中檢出,CRF07-BC亞型毒株主要從安順和貴陽地區(qū)的樣本中檢出,而為數(shù)較少的B亞型和CRF08-BC亞型毒株則主要從黔東南和貴陽地區(qū)的樣本中檢出。CRF01-AE和CRF07-BC亞型為主要流行毒株,CRF01-AE亞型毒株62例占總樣本數(shù)的52.1%,CRF07-BC亞型毒株49例占總樣本數(shù)的41.2%,且均為基因重組亞型。值得注意的是,在貴州省以往的研究中只檢出 B、B′、E、CRF07-BC、CRF08-BC亞型[6-7],CRF01-AE亞型毒株為此次研究發(fā)現(xiàn)。目前為止,貴州省 HIV-1毒株已檢出 B、B′、C、E、CRF07-BC、CRF08-BC、CRF01-AE 7種亞型。由此可見貴州省HIV-1毒株亞型種類繁多、分布廣泛而復(fù)雜。這必將給今后的防治工作帶來較大的難度。

3.2 亞型毒株的流行鏈 根據(jù)樹狀圖和表1分析,此次研究發(fā)現(xiàn)的CRF01-AE占較大比例,且在貴州首次發(fā)現(xiàn),是貴州省HIV-1亞型毒株流行特點的重大變化。據(jù)報道,此毒株源于泰國性服務(wù)人群,經(jīng)我國東南沿海多次傳入我國,主要在性傳播人群引發(fā)流行[8-9]。結(jié)合流行病學(xué)資料推測,貴州省 HIV-1 CRF01-AE亞型毒株,首先經(jīng)勞務(wù)輸出的沿海各省打工人群帶入本省,先在性服務(wù)人群中流行,然后再傳給吸毒人群。顯示貴州省HIV流行,以吸毒為主的傳播方式已逐步向性傳播方式擴散,應(yīng)該引起高度重視。

CRF07-BC亞型毒株是本次研究發(fā)現(xiàn)的第二優(yōu)勢亞型毒株。據(jù)文獻報道,該毒株由20世紀90年代中期從印度傳入緬甸,再傳入我國云南瑞麗的C亞型病毒與早先從緬甸傳入我國云南瑞麗的B′亞型病毒重組而成(CRF07-BC、CRF08-BC),此亞型毒株主要在吸毒人群中蔓延傳播[10-12]。鑒于貴州省早期研究中就已發(fā)現(xiàn)C、B′兩種亞型毒株[6],推斷貴州省CRF07-BC亞型毒株的形成,有可能通過性傳播雜交和共用注射器吸毒雜交兩種方式形成,主要通過云南、四川、廣西傳入[13-14]。

本次研究發(fā)現(xiàn)B、B′亞型毒株相對較少,不再成為貴州省HIV-1亞型毒株流行的優(yōu)勢毒株。由于B亞型毒株主要由泰國傳入云南,再由云南傳入河南[15],由到河南賣血人員帶入貴州省。表明,通過取締地下賣血,保障血液安全等措施成效顯著,輸血傳播已經(jīng)遏制。同時也說明輸血傳播的感染者相對穩(wěn)定,向周圍人群擴散不如吸毒或性傳播方式快,形成二代傳播少。

3.3 HIV-1亞型毒株在不同地區(qū)傳播人群中的分布 此次研究結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),各亞型毒株在不同地區(qū)傳播人群中的分布,存在顯著差異。尤其值得高度重視的是銅仁等地區(qū)的亞型毒株分布與以前的研究結(jié)果大相徑庭,以前的結(jié)果為B、CRF07-BC亞型毒株流行為主,而此次則以CRF01-AE流行為主,CRF01-AE所占比例為82.54%。由此表明:在一定區(qū)域內(nèi),新的HIV亞型毒株一旦形成,即可很快成為這一區(qū)域的優(yōu)勢毒株。

3.4 防治對策 通過本次研究結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),貴州省HIV-1流行優(yōu)勢毒株已不再是以前的B、B′亞型毒株,而是CRF01-AE亞型毒株。因此建議,在HIV防治對策上,亦應(yīng)對以往所采取的以阻斷吸毒人群傳播為主的防治措施調(diào)整為以阻斷性服務(wù)人群、社會流動人群、吸毒人群經(jīng)性傳播為主的綜合防治措施上來。防治重心、經(jīng)費投向、政策導(dǎo)向均應(yīng)作相應(yīng)的調(diào)整。只有這樣,進行全方位的HIV綜合防治,才能有效地阻止HIV病毒的傳播和蔓延,達到控制艾滋病流行的目的。

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