天花粉對(duì)腦缺血再灌注大鼠高同型半胱氨酸血癥的影響

陳 威 王 紅 張思為

暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（廣東深圳518020）

研究表明，高同型半胱氨酸血癥（Hhcy）可能是繼高血壓、高血脂、糖尿病、心臟病等傳統(tǒng)缺血性腦血管病發(fā)病的危險(xiǎn)因素外一個(gè)新的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1］。筆者采用大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）建立局灶性腦缺血再灌注（CIR）損傷模型，觀察天花粉對(duì)Hhcy大鼠CIR后細(xì)胞周期蛋白A（cyclinA）表達(dá)的影響，探討?zhàn)B陰法對(duì)缺血后神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料健康成年雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量200～250g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。天花粉精制液、補(bǔ)陽還五湯精制液，質(zhì)量濃度為1.0g/mL（深圳市人民醫(yī)院制劑中心制備）。

1.2 模型制作SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)、模型組、天花粉組、補(bǔ)陽還五湯組，每組各18只。各組根據(jù)缺血再灌注時(shí)間分為12、24、48h 3個(gè)亞組。線栓直徑為0.22～0.25mm的釣魚線，將一端輕輕沾上硅膠作成線栓頭（直徑約為0.28～0.30mm），陰干后用刻度尺測(cè)量距線栓頭18mm及20mm處用記號(hào)筆標(biāo)記記號(hào)，將線栓置于75%酒精中備用。參考Zea Longa［2］的模型制作方法進(jìn)行造模。大鼠用10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和翼腭動(dòng)脈。結(jié)扎翼腭動(dòng)脈，然后在距頸總動(dòng)脈分叉1cm處結(jié)扎頸外動(dòng)脈，并于距結(jié)扎處近端約0.5cm處遠(yuǎn)心端用電凝器灼斷之。動(dòng)脈夾夾閉左頸總動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈剪一切口，將一長5cm，直徑0.126mm尼龍線經(jīng)左側(cè)頸外動(dòng)脈主干切口緩慢向頸內(nèi)動(dòng)脈入顱方向推進(jìn)，以頸總動(dòng)脈分叉處為標(biāo)記，推進(jìn)18～20mm感到輕微阻力時(shí)，即阻斷大腦中動(dòng)脈，將線拴系緊防止滑出。阻斷3h后，撥出尼龍線至有輕微阻力時(shí)止，此時(shí)血流灌注成功，完成腦缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組除不插線外，全過程同其他各組。造模成功率為75%，死亡后補(bǔ)充動(dòng)物。

1.3 給藥方法實(shí)驗(yàn)前7d稱取體質(zhì)量后灌胃，2mL/100g，每日2次，分別在上午8：30和下午5：00進(jìn)行。假手術(shù)組予生理鹽水，模型組、天花粉組及補(bǔ)陽還五湯組以L-蛋氨酸1g/（kg·d）灌胃，天花粉組和補(bǔ)陽還五湯組分別給相應(yīng)藥液。采用盲法給藥，給藥由專人負(fù)責(zé)，造模者回避。

1.4 神經(jīng)病學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)各組動(dòng)物在12、24、48h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死前按照Longa的5分法評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行［2］：無神經(jīng)缺損為0分；提尾時(shí)左前肢內(nèi)收，不能完全伸直為1分；行走向左傾倒為2分；向左旋轉(zhuǎn)為3分；不能自己行走或昏迷為4分。1～4分為有效模型。

1.5 血漿中Hcy含量檢測(cè)各組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)抽血2mL，置含有20g/L乙二胺四乙酸二鈉100mL的一次性試管中，離心分離出血漿標(biāo)本置70℃保存，待標(biāo)本收集全后，應(yīng)用高效液相色譜法檢測(cè)血漿Hcy。

1.6 免疫組化測(cè)定分別于腦缺血再灌注12、24、48h各時(shí)間點(diǎn)用10%水合氯醛（0.35mL/100g）麻醉大鼠，4%的多聚甲醛灌注固定后斷頭取腦，于4%的多聚甲醛中浸泡24h，自視交叉向前后2mm切取冠狀腦片，取第3片行石蠟包埋，連續(xù)切片。石蠟切片脫蠟水化；用檸檬酸緩沖液（pH6.0）微波修復(fù)20min。滴加 50μL的兔多克隆 cyclin A 抗體（1∶100），置濕盒中 4℃過夜；沖洗后滴加50μL聚合物增強(qiáng)劑，室溫下孵育20min；沖洗后滴加50μL酶標(biāo)抗兔聚合物，室溫下孵育50min；沖洗后DAB鏡下顯色2～3min。陰性對(duì)照：用PBS代替兔多抗，其余步驟同前。陽性對(duì)照：應(yīng)用腸癌石蠟切片制作陽性對(duì)照片，其余步驟同前。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有關(guān)變量用（±s）表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用雙因素方差分析，整體上考察藥物處理因素與時(shí)間因素對(duì)結(jié)果的影響有無交叉，再通過單因素方差分析對(duì)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。單因素方差分析兩兩比較，如果尚不能確認(rèn)方差不齊，則采用Bonferroni檢驗(yàn)，如果已經(jīng)確定方差不齊，則采用Tamhane’s T2檢驗(yàn)。使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組神經(jīng)功能評(píng)分比較見表1。神經(jīng)學(xué)癥狀評(píng)分時(shí)間因素與藥物分組因素之間不存在交互作用。與模型組比較，天花粉組、補(bǔ)陽還五湯組神經(jīng)功能得到顯著改善（P＜0.05或0.01）；天花粉組、補(bǔ)陽還五湯組之間差別不明顯（P＞0.05）。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分（分，±s）

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分（分，±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。 下同。

組 別 n 再灌注12h再灌注24h再灌注48h藥物主效應(yīng)假手術(shù)組 18 0 0 0 0模型組 18 3.17±0.75 2.83±0.75 2.67±0.52 2.89±0.68補(bǔ)陽還五湯組 18 2.67±0.82* 2.33±0.52*2.17±0.41* 2.38±0.61*天花粉組 18 2.50±0.84**2.17±0.75**1.83±0.75**2.16±0.79**

2.2 各組血漿中Hcy含量比較見表2。血漿中Hcy含量時(shí)間因素與藥物分組因素之間存在交互作用。與模型組比較，天花粉組、補(bǔ)陽還五湯組Hcy含量減少（P＜0.05或0.01）；缺血再灌注24h，天花粉組與補(bǔ)陽還五湯組比較也顯著減少（P＜0.05）。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)血漿Hcy含量比較（μmol/L，±s）

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)血漿Hcy含量比較（μmol/L，±s）

與補(bǔ)陽還五湯組比較，△P＜0.05。下同。

組 別 n 再灌注12h 再灌注24h 再灌注48h假手術(shù)組 18 3.67±1.17 3.02±0.88 3.09±0.82模型組 18 19.92±2.31 37.39±2.91 36.35±1.12補(bǔ)陽還五湯組 18 10.84±1.09* 18.80±1.47* 16.94±1.17*天花粉組 18 10.40±1.32** 15.22±1.25**△ 15.01±1.55**△

2.3 各組cyclin A表達(dá)比較見表3。cyclin A陽性細(xì)胞數(shù)時(shí)間因素與藥物分組因素之間存在交互作用。缺血再灌注各時(shí)間點(diǎn)，與模型組比較，天花粉組、補(bǔ)陽還五湯組陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05或0.01）；缺血再灌注24h和缺血再灌注 48h，天花粉組與補(bǔ)陽還五湯組比較也顯著減少（P＜0.05）。

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)cyclinA陽性細(xì)胞數(shù)比較 （±s）

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)cyclinA陽性細(xì)胞數(shù)比較 （±s）

組 別 n 再灌注12h 再灌注24h 再灌注48h假手術(shù)組 18 3.11±1.45 3.28±1.40 2.0±1.03模型組 18 25.67±3.74 34.67±3.34 28.53±4.85補(bǔ)陽還五湯組 18 17.67±2.27* 20.16±3.38* 19.00±0.84*天花粉組 18 16.33±1.28** 16.0±2.45**△ 16.47±3.10**△

3 討 論

中風(fēng)的病機(jī)以氣虛血瘀、阻滯脈絡(luò)為主，本研究表明尚存在陰津虧虛。津血同源同行，津榮則血旺、津運(yùn)則血暢，若陰津不足，脈道枯澀，則脈絡(luò)瘀阻，產(chǎn)生瘀血，痹阻于腦絡(luò)，發(fā)為中風(fēng)。故本研究重用養(yǎng)陰藥天花粉，滋補(bǔ)陰液、增水行血、濡潤脈道，以利血行，從而達(dá)到防治缺血性中風(fēng)的目的。

腦缺血再灌注損傷是指腦缺血恢復(fù)血液灌注后，腦細(xì)胞損傷反而進(jìn)行性加重的過程。在此過程中Hhcy可能加重腦細(xì)胞損傷。目前研究發(fā)現(xiàn)，Hhcy對(duì)腦梗死影響的機(jī)制主要為（1）Hhcy對(duì)血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能的影響。血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)調(diào)節(jié)和維持血管系統(tǒng)的正常功能起著重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞為覆蓋在血管內(nèi)表面的單層扁平細(xì)胞，正常內(nèi)皮細(xì)胞既是感應(yīng)細(xì)胞又是效應(yīng)細(xì)胞，能感知血液中的炎癥信號(hào)、激素水平、切應(yīng)力、血壓等信息。在感知物理和化學(xué)因素刺激后，可合成和分泌多種血管活性物質(zhì)，如內(nèi)皮衍生的松弛因子（EDRF）、前列腺素 （PGs）、內(nèi)皮素 （ET）、血管緊張素Ⅱ、血栓素 A2（TXA2）等，這些活性物質(zhì)對(duì)血管舒縮功能的調(diào)節(jié)、凝血和抗凝血都有重要的作用。內(nèi)皮細(xì)胞的損傷在動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的形成過程中具有重要的始動(dòng)作用。Hhcy可能通過氧化應(yīng)激機(jī)制導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死、凋亡等損傷改變。有研究認(rèn)為，Hhcy可通過細(xì)胞內(nèi)外濃度梯度和轉(zhuǎn)運(yùn)裝置被動(dòng)或主動(dòng)地轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，通過巰基發(fā)生自氧化，產(chǎn)生過氧化氫、羥自由基 （·OH）、超氧陰離子等，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。當(dāng)金屬離子鐵、銅存在時(shí)，Hcy產(chǎn)生具有強(qiáng)烈細(xì)胞毒性的OH-OH-可作用于細(xì)胞膜內(nèi)不飽和脂肪酸，啟動(dòng)膜脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，功能喪失，導(dǎo)致動(dòng)脈硬化［3］。Hcy是一種炎癥刺激物，它可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生多種趨化因子和黏附分子損傷內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生。在病理情況下，VCAM-1在內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)異常增多。LiM等［4］也證實(shí)Hcy能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)和分泌VCAM-1，導(dǎo)致血管炎性損傷。（2）Hhcy促進(jìn)血小板聚集，Hcy可抑制內(nèi)皮細(xì)胞 ADP酶的活性，致使二磷酸腺苷（ADP）降解減少，凝血酶和 ADP可以改變花生四烯酸的代謝，促進(jìn) TXA2合成增多，引起血小板聚集，血小板在內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和聚集也是促進(jìn)凝血過程瀑布反應(yīng)的重要因素［5］。（3）Hhcy還可分別增加cyclin D和cyclin A的信使核糖核酸（mRNA）水平3倍和15倍，提示Hhcy誘導(dǎo)的cyclin的mRNA合成，對(duì)鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞由靜止期進(jìn)入增殖期起主要作用。cyclin A蛋白是細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)變過程中的一種重要調(diào)節(jié)蛋白，它的表達(dá)標(biāo)志著細(xì)胞周期進(jìn)入到G1晚期或G1晚期的機(jī)制激活。

本實(shí)驗(yàn)中，與模型組比較，天花粉組、補(bǔ)陽還五湯組各時(shí)間點(diǎn)血漿Hcy顯著降低，表明天花粉及補(bǔ)陽還五湯均能減少血漿Hcy，從而達(dá)到減輕腦缺血再灌注損傷的作用。腦缺血再灌注損傷能夠誘導(dǎo)Hhcy的出現(xiàn)，從而刺激大鼠腦內(nèi)的神經(jīng)元異常表達(dá)cyclin A蛋白，加重腦細(xì)胞的損傷，天花粉及補(bǔ)陽還五湯均可減少cyclin A蛋白的表達(dá)，其機(jī)制可能是通過減少血漿Hcy的含量。

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