清熱中藥對ApoE基因缺陷小鼠動脈粥樣硬化斑塊的影響*

盛小剛 潘光明 鄭朝陽 賴仁奎 吳 瑜 鄒 旭

廣東省中醫(yī)院（廣東廣州510120）

炎性反應(yīng)是冠狀動脈粥樣斑塊不穩(wěn)定的主要原因之一，促使急性冠脈綜合征（ACS）發(fā)生和發(fā)展。中醫(yī)學(xué)認為虛滯、瘀阻、毒損絡(luò)脈乃冠心病的基本病理變化。清熱類中藥具有抗菌、抗病毒的作用，并能抑制炎性介質(zhì)的合成和釋放。本研究選擇清熱中藥中5種代表藥物：清熱解毒藥（穿心蓮）、清熱燥濕藥（黃芩）、清熱瀉火藥（知母）、清熱涼血藥（牡丹皮）、清虛熱藥（青蒿），觀察其對ApoE基因缺陷小鼠動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備6～8周齡ApoE基因缺陷小鼠（品系C57BL/6J）80只，雌雄各半，體質(zhì)量18～20g，飼養(yǎng)條件為2級，室溫保持在 22～24℃，相對濕度 50%，光照時間 7：00-19：00。 飼以含脂肪21%、膽固醇0.15%的“西方類型膳食”飼料（60Co滅菌照射處理）。13周后，死亡6只，隨機處死4只，取主動脈，HE染色觀察基礎(chǔ)動脈粥樣硬化程度。

1.2 實驗分組70只成模小鼠隨機分成7組，每組10只。對照組予蒸餾水灌胃；中藥治療組再分為5個亞組，分別予穿心蓮（1560mg/kg）、黃芩（1950mg/kg）、知母（1950mg/kg）、牡丹皮（1950mg/kg）、青蒿（1560mg/kg）灌胃；辛伐他汀組予辛伐他?。?.6mg/kg）灌胃給藥。每日1次，療程共13周。實驗中小鼠共死亡17只。

1.3 觀察指標(biāo)藥物干預(yù)13周后，小鼠處死前禁食12h，2%戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔麻醉小鼠。血清學(xué)指標(biāo)及炎性因子測定：眼球摘除法獲得血液標(biāo)本，取血清，用日立7150全自動生物化學(xué)分析儀測定血漿總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）。病理形態(tài)學(xué)觀察：無菌條件下取出心臟和主動脈，10%甲醛固定，脫水，常規(guī)石蠟包埋切片，切片厚5μm，每只鼠的主動脈根部切片均取4個相同的切面，分別為（1）升主動脈最近端橫截面，切面形態(tài)呈圓形；（2）主動脈瓣附著部位，并有冠狀動脈開口；（3）主動脈瓣起始橫截面；（4）主動脈瓣完全出現(xiàn)并匯合在一起。每間隔100μm取6張，每個切面取連續(xù)的2張切片分別進行HE染色和Masson染色。利用計算機圖像分析儀對各個切面的動脈粥樣硬化斑塊面積進行分析、測定斑塊面積、血管橫截面積、脂質(zhì)中心面積、最小纖維帽厚度，計算校正斑塊面積（斑塊面積/血管橫截面積）及脂質(zhì)中心面積占斑塊面積百分比，每個標(biāo)本取4張切片的平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理計量資料以（±s）表示，用SPSS 11.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 模型組動脈粥樣硬化斑塊的觀察造模13周小鼠標(biāo)本HE染色顯示主動脈根部已形成粥樣硬化斑塊，內(nèi)膜增厚，內(nèi)皮下見較多的泡沫細胞和纖維帽形成。實驗26周后病變進一步加重，見明顯的粥樣斑塊，泡沫細胞、脂質(zhì)核心明顯，纖維帽薄，局部可見巨噬細胞聚集，血管中膜結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，脂質(zhì)侵蝕，鈣化。

2.2 各組小鼠血脂及hs-CRP測定結(jié)果比較見表1。實驗26周后，對照組和各中藥組血清TC、LDL-C水平明顯升高，各中藥組TC、TG、LDL-C、HDL-C水平與對照組無明顯差異，但hs-CRP 水平顯著低于對照組（P<0.05 或 0.01）。

表1 各組小鼠血脂水平比較（±s）

表1 各組小鼠血脂水平比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。 下同。

hs-CRP（mg/L）對照組 8 9.35±1.54 1.16±0.30 1.01±0.21 6.77±0.44 2.129±0.224穿心蓮組 8 8.77±0.78 1.20±0.28 0.97±0.24 6.30±0.83 1.579±0.329**黃芩組 8 8.52±1.17 1.43±0.32 0.85±0.30 6.50±0.50 1.034±0.347**知母組 7 8.40±1.12 1.21±0.34 0.97±0.22 6.23±0.81 0.938±0.364**牡丹皮組 8 8.93±1.34 1.32±0.31 1.04±0.17 6.17±0.69 1.776±0.320**青蒿組 7 9.32±0.71 1.31±0.36 1.00±0.25 6.48±0.47 1.175±0.317*辛伐他汀組 7 4.36±0.65**0.89±0.20 1.11±0.16 4.98±0.76**0.825±0.150**組 別 n TC（mmol/L）TG（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）

2.3 各組小鼠主動脈斑塊形態(tài)比較見表2。穿心蓮組、黃芩組的斑塊面積明顯低于對照組，黃芩組、知母組、青蒿組的校正斑塊面積明顯低于對照組，各中藥組脂質(zhì)中心面積明顯低于對照組，穿心蓮組、黃芩組、青蒿組的脂質(zhì)中心在主動脈斑塊中的百分比明顯于對照組；各中藥組的最小纖維帽厚度明顯高于對照組（P<0.05）。

表2 各組小鼠主動脈斑塊形態(tài)比較（±s）

表2 各組小鼠主動脈斑塊形態(tài)比較（±s）

最小纖維帽厚度（μm）對照組 8 87.51±14.88** 154.01±18.78 56.91±8.35** 24.75±4.98 28.37±3.60 15.76±3.26穿心蓮組 8 70.75±15.93** 150.50±16.54 47.43±11.51* 16.52±5.32** 23.16±3.84* 23.68±4.68**黃芩組 8 69.75±11.89** 157.75±19.05 44.27±5.26** 13.46±3.51** 19.34±4.27** 29.12±4.46**知母組 7 73.10±11.86** 155.28±11.90 47.26±8.16** 17.81±2.99** 24.83±5.48 22.61±3.77**牡丹皮組 8 74.88±12.92** 160.38±13.72 47.25±10.53 18.70±4.08* 25.73±5.84 20.75±2.63**青蒿組 7 76.43±10.15** 165.86±9.83 46.31±7.55* 17.41±1.67** 23.24±4.35* 20.39±2.13**辛伐他汀組 7 57.86±13.75** 160.71±19.44 36.77±10.77** 12.07±2.47** 21.74±5.74* 19.22±2.45*組 別 n 斑塊面積（×10-2mm2）原管腔面積（×10-2mm2）斑塊/原管腔面積比（%）脂質(zhì)面積（×10-2mm2）脂質(zhì)/斑塊面積比（%）

3 討 論

冠狀動脈粥樣斑塊的產(chǎn)生是一個長期漸進的病理過程，但ACS的發(fā)病是突然的，“熱毒”是ACS發(fā)作的重要誘因。熱毒系臟腑功能和氣血運行失常使機體內(nèi)的生理產(chǎn)物或病理產(chǎn)物不能及時排出，蘊積體內(nèi)化生而成，痰瘀互結(jié)，久郁化熱，這種病理產(chǎn)物“熱毒”也正是在此過程中產(chǎn)生并積累起來，其作用于人體進而加重病情［1］。虛滯、瘀阻、毒損絡(luò)脈乃冠心病的基本病理變化。外毒內(nèi)侵致病說早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就已提出，如《素問·痹論》有“脈痹不已，復(fù)感于邪，內(nèi)舍于心，發(fā)為心痹”和“邪在心，則病心痛”的記載。宋《圣濟總錄》指出，“其久心痛者，是心之別絡(luò)，為風(fēng)邪冷熱所乘痛也”，闡明風(fēng)寒風(fēng)熱等外邪皆可致病?？偨Y(jié)歷代醫(yī)家文獻，綜合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究成果，可認為ACS的炎癥發(fā)應(yīng)，相當(dāng)于中醫(yī)外邪人心，稽留不去，擾心侵脈；或痰瘀膠結(jié)，壅阻脈絡(luò)成毒，毒邪擾心。不管是外毒還是內(nèi)毒，最終都會誘發(fā)心脈痹阻而致胸痛發(fā)作。

目前認為炎性反應(yīng)是ACS發(fā)生和加重的重要原因，清熱類中藥在臨床實踐中大量應(yīng)用于抗感染性炎性并取得了良好的療效。研究表明清熱中藥具有抗菌、抗病毒的作用，而且對復(fù)雜的細胞因子網(wǎng)絡(luò)可進行精密協(xié)調(diào)，由此抑制炎性介質(zhì)的合成和釋放，調(diào)節(jié)炎性因子如腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素（IL）、血小板活化因子（PAF）、干擾素（IFN）及子一氧化氮等的分泌，改善炎性和組織損傷［2］。目前中醫(yī)藥界學(xué)者正就中醫(yī)藥對ACS的炎性反應(yīng)干預(yù)進行探討［3］，研究發(fā)現(xiàn)多種清熱中藥如穿心蓮、黃芩、知母、牡丹皮、青蒿具有心血管系統(tǒng)藥理作用，起到調(diào)脂、抗心肌缺血、保護內(nèi)皮細胞、抗動脈粥樣硬化等作用［4-6］。在臨床實踐中，在常規(guī)益氣活血化痰法中加入清熱類中藥治療冠心病不穩(wěn)定型心絞痛取得良好療效，血清炎性指標(biāo)CRP、IL-6、TNF-α等降低，表明清熱化痰活血法治療不穩(wěn)定型心絞痛對炎性反應(yīng)有抑制作用，通過抗炎及抗氧自由基作用，防止炎性造成的血管內(nèi)皮功能失常，從而抑制患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)，下調(diào)各項炎癥因子以及改善心肌缺血缺氧并穩(wěn)定冠狀動脈粥樣斑塊；其能改善不穩(wěn)定型心絞痛患者的近期預(yù)后可能主要是通過控制急性炎性反應(yīng)而達到的［7-8］。

本研究中以ApoE基因缺陷小鼠建立動脈粥樣硬化模型成功，病理觀察見明顯不穩(wěn)定斑塊存在，且hs-CRP明顯升高，而所有中藥組治療后hs-CRP水平較對照組明顯降低。各中藥組斑塊結(jié)構(gòu)較對照組有明顯變化，與對照組比較，穿心蓮組、黃芩組的斑塊面積明顯減少，黃芩組、知母組、青蒿組的校正斑塊面積顯著降低，各中藥組脂質(zhì)中心面積也明顯減少，穿心蓮組、黃芩組、青蒿組的脂質(zhì)中心在斑塊中的百分比明顯降低，各中藥組的最小纖維帽厚度明顯增厚，表明上述清熱中藥能改善動脈粥樣硬化斑塊結(jié)構(gòu)，減少不穩(wěn)定的脂質(zhì)中心面積，增加纖維帽厚度，使斑塊更趨于穩(wěn)定。有研究認為清熱解毒類中藥可以通過調(diào)節(jié)血脂、拮抗內(nèi)皮素、抑制平滑肌細胞增殖和抑制血小板聚集來對抗動脈粥樣硬化［9］。本研究中各中藥組的血脂水平與對照組并無差異，但hs-CRP水平明顯降低，考慮其改善斑塊的作用機制可能與減輕斑塊內(nèi)炎性反應(yīng)有關(guān)，尚待進一步探討。

［1］賴仁奎，盛小剛.冠心病熱毒病機與炎癥因子相關(guān)性探討［J］.中西結(jié)合心腦血管病雜志，2009（9）：1100-1101.

［2］沈自尹.清熱解毒藥對感染性炎癥作用原理的新認識［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1997，17（10）：628-629.

［3］楊忠奇.急性冠狀動脈綜合征的炎癥發(fā)應(yīng)與中醫(yī)藥干預(yù)［J］.福建中醫(yī)藥，2002，33（6）：45.

［4］吳偉，劉煜德，李榮，等.肺炎衣原體感染對動脈硬化斑塊面積的影響及黃芩苷的干預(yù)作用［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2006，23（4）：322-324.

［5］高福軍，張文高，周蘇寧，等.穿心蓮的心血管藥理作用研究進展［J］.中草藥，2000，31（10）：附 6-8.

［6］佟繼銘，陳光暉，劉玉玲，等.黃芩莖葉總黃酮對家兔實驗性動脈粥樣硬化的預(yù)防作用［J］.中草藥，2005，36（1）：93-95.

［7］洪永敦，黃衍壽，陳宇鵬，等.清熱化痰活血法治療冠心病不穩(wěn)定型心絞痛臨床研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1997，17（10）：628-629.

［8］王少英.清熱解毒藥物在治療冠心病中的運用［J］.北京中醫(yī)，2004，23（1）：14-15.

［9］范秀珍，胡維誠.清熱解毒類中藥抗動脈粥樣硬化作用機制的研究進展［J］.中國動脈硬化雜志，2004，12（2）：246-248.