四磨湯對慢性應激小鼠胃腸運動及腦內NT、CGRP的影響*

蔡光先 藺曉源 易 健 劉柏炎

湖南中醫(yī)藥大學省部共建中醫(yī)內科學教育部重點實驗室（湖南長沙410007）

功能性胃腸?。‵GIDs）是一組胃腸綜合征的總稱，多有精神因素的背景，主要為胃腸道的運動與分泌功能失調，而在病理解剖方面無器質性病理改變?，F(xiàn)代醫(yī)學認為胃腸動力障礙是這類疾病的重要發(fā)病機制之一。人類具有這樣或那樣的情緒體驗，是由外部環(huán)境刺激作用于中樞神經系統(tǒng)的結果，并通過腦腸軸的影響而引起不同的腦腸肽反應來改變胃腸活動。神經降壓素（NT）和降鈣素基因相關肽（CGRP）是廣泛分布于胃腸道的兩種重要的腦腸肽，目前大量研究表明其可減緩胃腸道運動［1-2］。四磨湯是治療FGIDs的有效方劑，臨床和實驗研究證明具有促胃腸動力的作用［3-4］。本實驗通過觀察四磨湯對慢性應激小鼠腦內NT、CGRP表達的影響，探討其調節(jié)胃腸動力的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料（1）動物：清潔級昆明種小鼠80只，雌雄各半，體質量（20±2）g，由湖南斯萊克景達實驗動物公司提供。 （2）藥物：四磨湯口服液（湖南漢森制藥股份有限公司），批號為091002183，規(guī)格為10mL/支。嗎丁啉（西安楊森制藥公司），批號為091130529，規(guī)格為10mg/片，用蒸餾水配制成50mg/100mL的藥液備用。（3）試劑：兔抗小鼠NT單抗，由北京博奧森生物技術有限公司提供，兔抗小鼠CGRP單抗，由武漢博上德生物工程有限公司提供；SP-9000免疫組化染色試劑盒（批號724944A）和液體AEC酶底物試劑盒（批號K96914D），由北京中杉金橋生物技術有限公司提供；水溶性封片劑，由武漢博士德生物工程有限公司提供。參考文獻［5］制備營養(yǎng)性半固體糊，冰箱冷藏，用時恢復至室溫。（4）儀器：英國Thermo公司 E60冰凍切片機；日本Olympus公司BX-51光學顯微鏡及Image-Pro Plus 5.1（IPP5.1）圖像分析系統(tǒng)；上海醫(yī)療器械七廠電熱恒溫水浴箱。

1.2 方法（1）分組與造模：所有小鼠適應性喂養(yǎng)3d后，隨機抽取20只作為正常組，其余動物開始造模，參考文獻［6］并加改進，制備不可預知的慢性應激模型，選取多種刺激因素對大鼠進行干預。①食物剝奪（24h）；②飲水剝奪合并空瓶刺激（12h）；③明暗顛倒（24h）；④濕籠飼養(yǎng)（24h）；⑤強迫游泳 （45℃，5min）；⑥倒懸（30min）；⑦行為束縛（30min）；⑧超聲刺激（2h）；⑨夾尾（1h）。每日隨機選取1種，相鄰2d的刺激不重復，連續(xù)刺激21d。各種刺激方法平均使用2～3次，應激處理在每日上午08：30開始更換。造模成功后，將模型動物隨機分為模型組、嗎丁啉組和四磨湯組，每組20只。（2）給藥：四磨湯組給予四磨湯口服液，嗎丁啉組給予嗎丁啉溶液，模型組給予蒸餾水，灌胃劑量均為7.56mL/（kg·d）（臨床等效劑量），連續(xù)用藥 7d，正常組常規(guī)喂養(yǎng)。（3）小鼠胃排空和小腸推進檢測：給藥第6日，每組隨機取10只小鼠禁食（自由飲水）24h后末次給藥，給藥后1h灌胃給予半固體糊（0.4mL/只），20min后頸椎脫臼法處死。打開腹腔，結扎幽門和賁門，取出胃，用濾紙擦干后稱全質量，然后沿胃大彎剪開胃體，洗去胃內容物后擦干，稱凈質量，以胃全質量和胃凈質量之差為胃內殘留物質量，計算胃內殘留物占所灌半固體糊質量百分比為胃內殘留率。同時迅速取出小腸，測量黑色半固體糊前沿至幽門距離（小腸推進長度）和幽門至回盲部距離（小腸總長度），按下列公式計算半固體糊推進百分率。推進率（%）=黑色半固體糊推進長度/小腸總長度×100%。（4）小鼠腦組織NT、CGRP表達檢測：其余小鼠以10%水合氯醛（4.0mL／kg）麻醉后，開顱取腦，4%多聚甲醛固定1h，依次放入15%、20%、30%蔗糖沉底24h。OTC包埋，冰凍切片機冠狀連續(xù)切片，18μm厚。切片放入3%H2O2去離子水孵育10min，以消除內源性過氧化物酶活性；PBS洗3min，3次；滴加100μL正常山羊血清室溫孵育 15min，傾去溶液；加入抗 NT、CGRP 小鼠抗體（濃度均為 1∶500），37℃孵育2h，PBS洗 3min，3次；加入 SP-9000生物素化二抗工作液100μL，37℃ 30min，PBS洗 3min，3次； 加入辣根酶標記鏈酶卵白素工作液 100μL，37℃ 30min，PBS 洗 3min，3 次：滴加 AEC 顯色劑100μL 10min，雙蒸水充分沖洗以終止染色；貼片，并用水溶性封片劑封片。同時用正常山羊血清和PBS代替一抗作空白對照以檢查免疫反應的特異性。每張切片置于400倍鏡下隨機選取陽性表達細胞不重復的5個視野，用IPP5.1圖像分析系統(tǒng)自動計數(shù)免疫陽性細胞數(shù)，計算其平均值。

1.3 統(tǒng)計學處理用SPSS 16.0軟件統(tǒng)計。資料以（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 四磨湯對慢性應激小鼠胃腸運動功能的影響模型組小鼠胃排空和小腸推進功能降低，與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。給藥后，四磨湯組胃內殘留率降低，小腸推進率升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠胃內殘留率和小腸推進率的比較 （%，±s）

表1 各組小鼠胃內殘留率和小腸推進率的比較 （%，±s）

與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同。

組 別 n 胃內殘留率 小腸推進率正常組 10 49.60±8.61△△* 52.04±3.65△△模型組 10 59.20±7.54 44.90±4.61嗎丁啉組 10 50.92±7.59△ 50.25±4.33△△四磨湯組 10 51.15±7.06△ 49.32±4.03△

2.2 四磨湯對慢性應激小鼠腦組織NT表達的影響NT在正常腦組織中有一定量的表達，陽性細胞呈現(xiàn)紅褐色，主要分布于下丘腦，以星狀、條索狀形態(tài)多見。慢性應激后，模型小鼠NT陽性細胞染色較深，數(shù)量較多，與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；四磨湯組NT表達下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 見圖 1，表 2。

圖1 各組小鼠腦內NT陽性細胞表達（×400）

表2 各組小鼠腦NT、CGRP陽性細胞數(shù)比較 （個/mm2，±s）

表2 各組小鼠腦NT、CGRP陽性細胞數(shù)比較 （個/mm2，±s）

組 別 n NT CGRP正常組 10 24.16±2.36△△△ 25.82±2.66△△模型組 10 28.94±2.03 32.04±2.85嗎丁啉組 10 25.00±2.50△ 26.02±2.89△四磨湯組 10 26.24±2.57△△ 26.60±3.08△△

2.3 四磨湯對慢性應激小鼠腦組織CGRP表達的影響CGRP在正常腦組織的陽性表達呈胞質紅褐色染色，不同部位的CGRP表達形態(tài)多樣，以下丘腦的梭形、多角形多見。模型組CGRP陽性細胞染色深，數(shù)量增多，與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；四磨湯組CGRP表達下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。 見圖 2，表 2。

圖2 各組小鼠腦內CGRP陽性細胞表達（×400）

3 討 論

隨著對心理生物醫(yī)學模式的深入，人們逐漸認識到中樞在FGIDs發(fā)病中的重要性，神經胃腸病學成為近年來研究的重點。目前認為，F(xiàn)GIDs表現(xiàn)出的動力和感覺功能的障礙，是基于異常的神經胃腸病學基礎，即胃腸動力與感知的神經網絡調節(jié)系統(tǒng)的異常，包括神經遞質的基礎。消化道感染和炎癥與FGIDs發(fā)病的密切關系構成了腦-腸軸調節(jié)中的周圍環(huán)節(jié)，同時各種原因引起的心理生理異常是FGIDs腦-腸軸調節(jié)重要的中樞環(huán)節(jié)［7］。腦腸肽是一類具有神經遞質和激素雙重功能的小分子多肽，既可作為腸道肽能神經釋放的神經遞質或調節(jié)介質起調節(jié)作用，也可直接作用于胃腸道感覺神經末梢或平滑肌細胞的相應受體而調節(jié)腸道的感覺和運動，同時亦參與中樞神經系統(tǒng)調節(jié)胃腸道的功能［8］。其調節(jié)功能主要通過3個途徑：其一是通過血液以內分泌形式作用于胃腸道細胞相應的受體；其二以腸道肽能神經遞質形式調節(jié)胃腸功能；其三由腦腸肽在中樞神經系統(tǒng)水平高低的變化來影響胃腸功能，而下丘腦在胃腸功能的中樞調節(jié)中起重要作用［9］。

NT是廣泛分布于胃腸道（約85%）和腦（約10%）中的一種腦腸肽。其在中樞神經系統(tǒng)主要分布于下丘腦和基底前腦，其次為基底節(jié)、腦干，在丘腦和大腦皮質分布較少［10］。正常生理情況NT可抑制胃腸運動和胃、十二指腸、結腸的機械運動。Sako F等［1］研究表明，NT可抑制胃腸道運動，延緩胃排空。Nightingale JMD等［11］研究發(fā)現(xiàn)，回腸切除術后的患者由于N細胞減少，血漿NT水平降低，從而導致液體胃排空加速。CGRP是由37個氨基酸組成，廣泛分布于中樞和外周神經系統(tǒng)及某些非神經組織，是腦腸軸發(fā)揮作用的主要中介之一，能從整體水平上調節(jié)胃腸激素的分泌，抑制胃腸道運動及對胃黏膜有保護作用等，此外CGRP能促進胃腸生長抑素（SS）的釋放。有研究表明［12］CGRP通過引起胃底縱行肌和胃竇部環(huán)行肌松弛，胃內壓降低，進而引起胃排空延遲。CGRP能抑制結腸縱、環(huán)行肌的自主收縮，抑制直腸縱行肌、肛門內括約肌的收縮［13］。

FGIDs屬中醫(yī)學“胃脘痛”、“痞滿”、“納呆”等范疇，與肝脾功能密切相關。肝主疏泄而調暢情志，情志所傷，肝木有病，則氣機不舒，脾主運化受制。四磨湯源于宋代嚴用和《重訂嚴氏濟生方》，全方由木香、枳殼、烏藥、檳榔組成，有順氣降逆、消積止痛之功。臨床上廣泛用于治療功能性消化不良、便秘型腸易激綜合征及非胃術后胃腸排空障礙等FGIDs療效顯著。

本研究顯示，慢性應激模型小鼠胃排空和小腸推進功能下降，腦內NT和CGRP的表達明顯增強，與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義。經藥物治療后，四磨湯組小鼠胃腸運動功能恢復正常；NT和CGRP的表達降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義，與正常組相近。本實驗表明調節(jié)NT、CGRP的水平變化可能是四磨湯治療FGIDs的作用機制之一。

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