針刺對抑郁癥睡眠障礙大鼠行為學(xué)和海馬5-羥色胺受體表達水平的影響?

甄君，范建中，姚曉黎，舒曉春，楊艷杰，孔梅

睡眠障礙是抑郁癥狀群的重要組成部分，是抑郁癥最早和最常見的癥狀之一，以入睡困難、睡眠不深及早醒為特征。睡眠障礙可加重抑郁癥的病情，延緩抑郁癥的康復(fù)進程。嚴(yán)重的抑郁癥睡眠障礙和自殺有關(guān)，而且對多種抗抑郁藥物治療反應(yīng)差。在抑郁癥的治療中，不僅要關(guān)注抑郁癥狀的緩解，也應(yīng)重視睡眠障礙的改善。抑郁癥睡眠障礙(sleep deprivation depression,SDD)的研究已成為人們關(guān)注的焦點。以往研究提示，5-羥色胺受體(5-HTR)參與人類情感、認知及感覺等行為，尤其是海馬5-HT1AR、5-HT2AR表達變化與抑郁睡眠障礙密切相關(guān)[1-2]。本研究觀察針刺對SDD大鼠海馬5-HT1AR、5-HT2AR的影響，以期為針刺治療SDD提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康清潔級Wistar大鼠36只，體重200～250 g，雌雄各半(廣東省動物實驗中心提供，實驗動物批號：SCXK(粵)2008-0002)。

首先用Open-Field法[3]進行行為學(xué)評分，選擇得分相近的36只大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常組、模型組與針刺組，每組12只。正常組每籠飼養(yǎng)6只，其余各組動物每籠1只孤養(yǎng)。

1.2 主要實驗儀器與試劑 BDC-280e超低溫冰箱：長沙伊來克斯；5417R型高速冷凍離心機：德國EPPENDORF公司；Real-time PCR檢測儀：7300Sequence Detection System ABI-7500，美國ABI公司；大鼠5-HT1A、5-HT2A、β-actin基因引物：上海生工生物技術(shù)有限公司合成；SYBRGreen PCR試劑盒：廣州達暉生物公司。

1.3 抑郁模型及睡眠剝奪干預(yù) 參考文獻[4]制作抑郁模型大鼠。除正常組外，其余各組每日隨機安排1種應(yīng)激，包括：行為限制2 h、電擊足底(36 V交流電，每隔1 min刺激1次，每次刺激10 s，共30次)、冰水游泳(4℃，5 min)、熱應(yīng)激(45℃，5 min)、搖晃(1/s，共15 min)、鼠籠傾斜45°24 h、夾尾1 min、禁水24 h、禁食48 h、明暗顛倒、潮濕墊料10 h、空瓶放置1 h。連續(xù)18 d。從第19天開始，連續(xù)72 h快速動眼相睡眠剝奪，采用小平臺水環(huán)境法[5]。剝奪箱為30×30×40 cm的玻璃水箱，正中立一個直徑6 cm圓形平臺，箱中注滿水，水面距平臺面約1 cm。大鼠在平臺上可自由進食進水；如果睡眠，會因為肌張力松弛而落入水中。造模期間持續(xù)燈光照射，室內(nèi)溫度控制在18.0℃～22.0℃，水溫保持在20℃左右。

1.4 干預(yù)方法 正常組：常規(guī)飼養(yǎng)，不接受任何刺激與處置。模型組：不予任何治療。針刺組：根據(jù)《實驗針灸學(xué)》[6]大鼠穴位定位方法取百會、神庭和內(nèi)關(guān)。穴位常規(guī)消毒，采用蘇州醫(yī)療用品廠生產(chǎn)的華佗牌0.25×25 mm針灸針進行針刺。百會、神庭向尾部斜刺，進針深度約為2 mm，內(nèi)關(guān)直刺1 mm，每穴均勻捻轉(zhuǎn)刺激30 s，留針15 min。每天在安排應(yīng)激前1 h開始進行針刺，每日1次，連續(xù)21 d。

1.5 行為學(xué)測定 使用Open-Field法評分，以大鼠在3 min內(nèi)的水平運動得分和垂直運動得分之和為大鼠總的自主活動量，于分組前和造模21 d后進行。

1.6 海馬5-HT1AR、5-HT2AR mRNA檢測 造模21 d，于進行行為學(xué)評分后處死大鼠，取大鼠海馬置液氮中待檢。5-HT1AR、5-HT2AR引物序列、擴增長度及PCR反應(yīng)條件見表1，以β-actin為內(nèi)參。Trizol試劑一步法抽提總RNA后，取RNA產(chǎn)物1.0 μg，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，然后用PCR擴增儀進行PCR反應(yīng)。用2%瓊脂糖電泳，電泳結(jié)束后置凝膠成像系統(tǒng)中進行分析，計算與內(nèi)參β-actin的比值用以校正。

表1 5-HT1AR、5-HT2AR、β-actin引物序列、擴增長度

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)用±s)表示，符合正態(tài)分布資料采用單因素方差分析，非正態(tài)分布資料采用Mann-WhitneyU秩和檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 自主活動 應(yīng)激前各組大鼠的自主活動無顯著性差異(P＞0.05)。接受應(yīng)激21 d后，模型組自主活動較正常組明顯減少(P＜0.01)。與模型組比較，針刺組在治療后大鼠自主活動明顯增加(P＜0.01)。見表2。

2.2 海馬5-HT1AR、5-HT2AR mRNA表達 與正常組比較，模型組大鼠海馬5-HT1AR mRNA表達水平明顯下降、5-HT2AR mRNA表達水平明顯上升(均P＜0.01)；與模型組比較，針刺組大鼠海馬5-HT1AR mRNA表達水平上調(diào)，5-HT2AR mRNA表達水平下降(均P＜0.05)。見表3。

3 討論

睡眠具有維持個體生存、促進生長發(fā)育、調(diào)整和恢復(fù)體力、促進學(xué)習(xí)、形成記憶的功能。睡眠剝奪可引起情緒、學(xué)習(xí)記憶、免疫功能等一系列變化[7]，對人們的身心健康、日常生活與工作有很大影響。睡眠障礙不但是抑郁癥的癥狀之一，同時也是導(dǎo)致抑郁癥的主要因素之一；睡眠障礙的改善對抑郁癥的緩解與康復(fù)有促進作用。抑郁癥睡眠障礙的發(fā)病機制至今未徹底闡明。一般認為，抑郁癥除了與心理、社會因素和遺傳因素有關(guān)外，主要還與中樞去甲腎上腺素(NE)、5-HT等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)減少、受體敏感性改變以及遞質(zhì)間失衡等因素有關(guān)。有研究提示，抑郁癥的睡眠障礙與抑郁癥發(fā)病機制有關(guān)[8]。作為腦邊緣系統(tǒng)重要組成部分的海馬與抑郁癥關(guān)系十分密切[9]。海馬區(qū)域5-HT含量或功能異?？赡芘c精神疾病、睡眠障礙等多種疾病有關(guān)。

表2 各組大鼠自主活動量的變化

表3 各組大鼠海馬5-HT1AR、5-HT2AR mRNA的表達

分子生物學(xué)與藥理學(xué)的研究結(jié)果顯示，目前人類5-HTR至少存在7種亞型，其中5-HTlR和5-HT2R家族與抑郁癥關(guān)系密切。5-HTR中含量最豐富的是5-HT1AR，按其分布位置可以分為突觸前膜受體和突觸后膜受體兩類，兩者共同作用調(diào)節(jié)5-HT的釋放[10]。突觸后膜受體廣泛分布于5-HT能神經(jīng)傳入的前腦區(qū)，尤其是皮質(zhì)、海馬、中隔、杏仁體及下丘腦，定位于神經(jīng)元的軸突上，被激活后引起突觸后膜超極化，抑制神經(jīng)元的興奮性[11]。研究表明，5-HT2AR及5-HTlAR的表達與睡眠障礙相關(guān)[12]，拮抗5-HT2AR上調(diào)具有明確改善睡眠障礙的效應(yīng)。

針刺是我國傳統(tǒng)中醫(yī)療法，在治療抑郁方面與藥物比較具有起效快、整體調(diào)節(jié)、多靶點作用、安全性高、無副作用等優(yōu)點。實驗研究證實，針刺治療可以改善抑郁癥模型大鼠的行為學(xué)異常，起效快，且能夠通過改善前額皮質(zhì)區(qū)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量而發(fā)揮抗抑郁作用[13]。

古代文獻中有很多關(guān)于將百會、神庭、內(nèi)關(guān)穴用于調(diào)神和治療情志病的記載。百會、神庭為督脈經(jīng)穴，督脈上行入腦，且百會位居巔頂，為百脈聚會之處，可清利頭目、疏通腦絡(luò)，健腦寧神，此2穴合用，具有調(diào)節(jié)腦神、安神鎮(zhèn)靜的作用。內(nèi)關(guān)為手厥陰心包經(jīng)之絡(luò)穴，通陰維脈，別走手少陽三焦經(jīng)，三焦主氣，有寬胸理氣、疏通氣血、養(yǎng)心安神之效。

本研究綜合孤養(yǎng)與不可預(yù)見的慢性應(yīng)激刺激誘導(dǎo)建立抑郁大鼠模型，同時應(yīng)用小平臺水環(huán)境法對抑郁模型大鼠進行72 h的連續(xù)快速動眼相睡眠剝奪。結(jié)果顯示，針刺對SDD大鼠具有良性的整體調(diào)節(jié)作用，可能通過上調(diào)海馬5-HT1AR、下調(diào)5-HT2AR表達來調(diào)整5-HT受體間不平衡，從而發(fā)揮治療效應(yīng)。

由于針刺治療具有整體調(diào)節(jié)、多靶點作用等特點，關(guān)于針刺治療SDD的確切機制還有待于今后進行更深入的研究。

[1]Wei H,Ma A,Wang YX,et al.Role of spinal 5-HT receptors in cutaneous hypersensitivity induced by REM sleep deprivation[J].Pharmacol Res,2008,57(6):469-475.

[2]Landolt HP,Wehrle R.Antagonism of serotonergic 5-HT2A/2C receptors:mutualimprovementofsleep,cognition and mood?[J].Eur J Neurosci,2009,29(9):1795-1809.

[3]de Oliveira RA,Cunha GM,Borges KD,et al.The effect of venlafaxine on behaviour,body weight and striatal monoamine levels on sleep-deprived female rats[J].Pharmacol Biochem Behav,2004,79(3):499-506.

[4]de Vasconcelos CA,De Oliveira JA,De Oliveira Costat LA,et al.Malnutrition and REM-sleep deprivation modulate in rats the impairment of spreading depression by a single sub-convulsing dose of pilocarpin[J].Nutr Neurosci,2004,7(3):163-170.

[5]Lopez-Rodriguez F,Kim J,Poland RE.Total sleep deprivation decreases immobility in the forced-swim test[J].Neuropsychopharmacology,2004,29(6):1105-1111.

[6]李忠仁.實驗針灸學(xué)[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2003:360.

[7]Bueno OF,Lobo LL,Olive drab MG,et al.Dissociated paradoxical sleep deprivation effect soninhibiting avoidance and conditioned fear[J].Physiol Behav,1994,56(4):775-779.

[8]余海英,崔庶,王宏,等.抑郁癥患者睡眠行為及睡眠生理障礙的研究[J].中華精神科雜志,2000,33(1):23-25.

[9]Shirayama Y,Chen A.Brain-derived neurotrophic factor produces antidepressant effects in behavioral models of depression[J].J Neurosci,2002,22(8):3251-3261.

[10]Alexandre C,Popa D,Fabre V,et al.Early life blockade of 5-hydroxytryptamine 1A receptors normalizes sleep and depression-like behavior in adult knock-out mice lacking the serotonin transporter[J].J Neurosci,2006,26(20):5554-5564.

[11]Novati A,Roman V,Cetin T,et al.Chronically restricted sleep leads to depression-like changes in neurotransmitter receptor sensitivity and neuroendocrine stress reactivity in rats[J].Sleep,2008,31(11):1579-1585.

[12]Pozzi L,Greco B,Sacchetti G,et al.Blockade of serotonin 2A receptors prevents PCP-induced attentional performance deficit and CREB phosphorylation in the dorsal striatum of DBA/2 mice[J].Psychopharmacology,2010,208(3):387-399.

[13]張建斌,王玲玲,呂梅,等.針刺對抑郁癥模型大鼠前額皮質(zhì)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響[J].中國臨床康復(fù),2006,10(15):129-131.