建立新西蘭白兔深靜脈血栓模型的實(shí)驗(yàn)研究

鄭玉江，湯慶，鄧方閣，張浩

深靜脈血栓形成(deep venous thrombosis,DVT)多見于下肢，嚴(yán)重危害人類的生命與健康。DVT的動(dòng)物模型是研究體內(nèi)靜脈血栓形成發(fā)病機(jī)制和評(píng)價(jià)相應(yīng)治療方法的重要工具。DVT形成的三要素為血流緩慢、血管壁損傷、血液高凝狀態(tài)[1]。本實(shí)驗(yàn)采用同時(shí)滿足上述條件來(lái)激活凝血系統(tǒng)，形成穩(wěn)定血栓，構(gòu)建兔DVT模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)健康新西蘭大白兔8只，雌雄不限，體重約2.0～2.5 kg，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)：0070409)。實(shí)驗(yàn)前正常飼養(yǎng)1周。采用自身對(duì)照研究，任意選擇一側(cè)股靜脈為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)側(cè)股靜脈為對(duì)照組。

1.2 模型制備 3%戊巴比妥鈉1 ml∕kg兔耳緣靜脈注射麻醉，密切觀察其心率和呼吸變化。將兔仰臥位固定，雙側(cè)后肢內(nèi)側(cè)區(qū)備皮、消毒。沿右(或左)下肢近端沿股靜脈的走向，做長(zhǎng)約4 cm的斜形皮膚切口，分離皮下及肌肉組織，可見股動(dòng)脈、股靜脈及股神經(jīng)相伴行。小心分離股靜脈，避免撕裂管壁。游離股靜脈約2 cm，血管夾夾閉近心端，以無(wú)齒鑷鉗夾遠(yuǎn)端血管壁10次，在血管夾遠(yuǎn)心端約1 cm處用1 ml注射器平行向心插入股靜脈，注入0.1 ml凝血酶(終濃度150 U∕ml，湖南一格制藥有限公司生產(chǎn))，迅速退出針頭，按壓針孔處數(shù)分鐘。血管夾保留2 h，期間不定時(shí)向組織滴加生理鹽水以保持濕潤(rùn)。2 h后緩慢取出血管夾，分層縫合肌肉與皮膚。對(duì)照側(cè)肢體不做處理。肌注硫酸慶大霉素40000 U(湖北天藥藥業(yè)股份有限公司)。術(shù)畢，手術(shù)側(cè)肢體加小夾板行石膏繃帶固定于屈髖屈膝位，放回兔籠繼續(xù)飼養(yǎng)48 h。模型制備后每天觀察實(shí)驗(yàn)兔的一般狀態(tài)并記錄。

1.3 彩色多普勒超聲檢測(cè) SEQUOIA-512型彩色多普勒超聲診斷儀(德國(guó)西門子公司，實(shí)時(shí)凸陣探頭，頻率10 MHz，可自動(dòng)計(jì)算流速)對(duì)兔的雙側(cè)股靜脈進(jìn)行二維、彩色多普勒(CDFI)及頻譜多普勒(PW)超聲掃查，觀察血栓形成及靜脈血流情況。

1.4 病理學(xué)檢查 模型制備后48 h，靜脈注入過(guò)量戊巴比妥鈉溶液處死動(dòng)物。取血栓形成節(jié)段及對(duì)側(cè)正常節(jié)段股靜脈血管置于10%中性福爾馬林溶液中固定，48 h后石蠟包埋，橫切血管段制成病理切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色，置顯微鏡下觀察血栓形成情況。

2 結(jié)果

圖1 DVT模型彩色多普勒超聲檢測(cè)

2.1 一般狀態(tài) 8只兔均存活，未出現(xiàn)靜脈血管損傷破裂出血等嚴(yán)重并發(fā)癥以及呼吸困難、氣促、嗆咳、休克等肺動(dòng)脈栓塞癥狀，精神尚可，下肢活動(dòng)受限。其中3只兔手術(shù)側(cè)肢體明顯腫脹伴發(fā)熱。

2.2 超聲檢測(cè) 見雙側(cè)股靜脈管腔均表現(xiàn)為無(wú)回聲。探頭加壓，實(shí)驗(yàn)側(cè)股靜脈不能被壓癟，對(duì)照側(cè)可壓癟。CDFI及PW示實(shí)驗(yàn)側(cè)靜脈管腔內(nèi)無(wú)彩色血流及血流頻譜信號(hào)，對(duì)照側(cè)可見充盈管腔的彩色血流信號(hào)及隨呼吸變化的血流頻譜(圖1)。

2.3 病理學(xué)檢查 8只動(dòng)物均成功建立股靜脈血栓模型，4只位于左側(cè)，4只位于右側(cè)。血栓段股靜脈肉眼下見血栓充滿靜脈管腔，呈紫紅色，與管壁無(wú)粘連。光鏡下可見血管內(nèi)皮細(xì)胞不完整以及均質(zhì)粉染的血栓，血栓主要為均勻分布的紅細(xì)胞，其間可見纖維素網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及散在血小板及白細(xì)胞。對(duì)照側(cè)股靜脈血管內(nèi)膜表面光滑、平整，未見血栓形成(圖2)。

圖2 DVT模型的病理檢測(cè)

3 討論

DVT是臨床常見疾病，發(fā)病率在國(guó)內(nèi)外均呈逐年增多趨勢(shì)，具有很高的致殘率及致死率[2-3]。目前關(guān)于DVT形成的危險(xiǎn)因素也不斷補(bǔ)充和完善，如年齡、肥胖、靜脈曲張、吸煙、髂動(dòng)脈壓迫綜合征等[4]；這些危險(xiǎn)因素可相互疊加、相互影響[5]，最終導(dǎo)致血流滯緩，血管內(nèi)皮缺氧、受損，血液高凝，從而促使DVT的發(fā)生。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇新西蘭白兔進(jìn)行DVT模型制備，因?yàn)榕c鼠等小型動(dòng)物相比，兔的股靜脈壓力較高，血流量較充足，且血栓形成迅速，并可充盈整個(gè)血管腔，易于觀測(cè)；同時(shí)新西蘭白兔比起犬、豬等大型動(dòng)物，其價(jià)格經(jīng)濟(jì)，性情溫順，易于超聲檢查。

目前，單純靜脈結(jié)扎是制備血栓模型的確切方法，但較為耗時(shí)[6]。本實(shí)驗(yàn)采用注入凝血酶以加快血栓形成。當(dāng)血管夾在近端阻滯股靜脈后，在股靜脈遠(yuǎn)端注入凝血酶。由于凝血酶注入后可使靜脈管腔張力增加，管壁由原來(lái)的淡粉色變成半透明色，當(dāng)注射針孔經(jīng)過(guò)短暫幾分鐘的壓迫后即可止血，并迅速形成肉眼可見的血栓。在血栓形成后0.5 h，暗紅色的血栓逐漸向近心端蔓延，表明本實(shí)驗(yàn)制備DVT模型時(shí)在近端阻滯靜脈，遠(yuǎn)端注入凝血酶的方法可行，不僅可形成確切的血栓，還有效地提高建模的成功率。這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[6]。

術(shù)后48 h實(shí)驗(yàn)側(cè)股靜脈病理結(jié)果示管腔內(nèi)血栓充盈，血管內(nèi)皮細(xì)胞不完整，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血栓與管腔無(wú)粘連，這與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，同時(shí)也符合人體DVT急性期病理表現(xiàn)[7-8]。由于這個(gè)時(shí)候血栓尚未與血管壁發(fā)生機(jī)化、粘連，采用溶栓療法和取栓術(shù)均能取得滿意的效果[9]。

本實(shí)驗(yàn)術(shù)后的肢體制動(dòng)也很重要。因?yàn)樾纬沙跗诘撵o脈血栓與管壁粘連不緊，質(zhì)地松脆，活動(dòng)或按壓肢體易使血栓脫落導(dǎo)致肺栓塞。新西蘭白兔雖然是較溫順的動(dòng)物，但喜咬嚙，單純的石膏繃帶達(dá)不到固定的目的，故我們采用小夾板與石膏繃帶共同固定的方法。

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