研究分子鑒別診斷在呼吸道感染檢測中的應(yīng)用

黃平 謝名娟 田晶晶

(湖南省常德市第一人民醫(yī)院 湖南常德 415000)

急性呼吸道感染90%以上是由病毒引起的,其中以呼吸道病毒最常見[1]。它是一種全球范圍的常見多發(fā)疾病。近年來新發(fā)呼吸道傳染病如SARS、禽流感及豬流感(H1N1)的爆發(fā)和流行,對(duì)人類的健康帶來巨大的沖擊。呼吸道傳染病病情復(fù)雜,傳播速度快,尤其對(duì)弱勢群體(老年人及嬰幼兒)及抵抗能力較差的載體造成極大威脅。呼吸道傳染性疾病臨床表現(xiàn)相似,較難依靠臨床癥狀診斷。以往的確診方法為病原體的分離培養(yǎng),獲得結(jié)果周期較,且每次實(shí)驗(yàn)只能鑒定一種病原體,不能滿足快速應(yīng)急的病原診斷,不利于及時(shí)采取措施控制其傳播,所以必須將高通量快速檢測技術(shù)應(yīng)用于呼吸道病原體的檢測,以便為治療疾病、控制疫情和臨床治療提供可靠依據(jù)。

本研究有機(jī)結(jié)合先進(jìn)的Tem-PCR(靶序列富集多重PCR)多重?cái)U(kuò)增技術(shù)和液相芯片(xMAP)檢測技術(shù),建立常見呼吸道病原體的分子鑒別診斷(MDD)平臺(tái),克服了病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)診斷及單一PCR的缺點(diǎn),可以同時(shí)檢測出多種病毒引起的呼吸道感染。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采集我院呼吸科住院患者呼吸道灌洗液樣品5例,咽拭子樣品5例。病原體的DNA純化試劑盒QIAamp DNA Mini Kit和RNA純化試劑盒QIAamp RNA MiniKit、DNA擴(kuò)增試劑盒HotStar Taq Master Mix Kit和RNA擴(kuò)增試劑盒OneStep RT-PCR Kit,以及呼吸道病原體檢測試劑盒Resplex I和Resplex II均購自德國Qiagen公司。PCR儀為美國ABI公司的2720 Thermal Cycler,液相芯工作站為德國Qiagen公司Luminex Liquichip200。

1.2 方法

對(duì)同一份樣品分別純化DNA和RNA,提取病原體核酸并進(jìn)行擴(kuò)增。用Resplex I和Resplex II試劑盒及液相芯片工作站進(jìn)行PCR產(chǎn)物雜交及檢測。

2 結(jié)果

2.1 驗(yàn)證MDD檢測平臺(tái)可靠性

用已知陽性樣品,經(jīng)Tem-PCR和雜交后檢測,驗(yàn)證整個(gè)檢測系統(tǒng)的可靠性。用Resplex I檢測5種遺傳物質(zhì)為DNA的病原體:ADV細(xì)胞培養(yǎng)物、NMG菌液、HFLU菌液、LPN菌液;用Resplex II檢測4種遺傳物質(zhì)為RNA的病原體:INFA分離株、INFB分離株、RSV、CEVE。均獲得強(qiáng)陽性結(jié)果,且有高度的特異性,說明該系統(tǒng)可靠、敏感,能在一次反應(yīng)對(duì)多種病原體進(jìn)行檢測。

表1 以Resplex I對(duì)樣品中遺傳物質(zhì)為DNA的病原體的檢測

表2 以ResplexⅡ?qū)悠分羞z傳物質(zhì)為RNA的病原體的檢測

2.2 MDD檢測平臺(tái)的應(yīng)用

以液相芯片和實(shí)時(shí)熒光PCR儀對(duì)未知樣品進(jìn)行檢測。對(duì)10例臨床樣品進(jìn)行檢測的結(jié)果顯示,呼吸道灌洗液陽性檢出率高于門診病例咽拭子樣品的陽性檢出率,RNA病原體(以病毒為主)的陽性率高于DNA病原體(以細(xì)菌為主)的陽性率(表1、2)。部分患者有多種病原體同時(shí)感染存在,即有不同種屬病原體的共存,也有同一種類不同亞型病原體的共存。這些信息是用常規(guī)方法一次實(shí)驗(yàn)所根本無法提供的。

3 討論

急性呼吸道感染絕大多數(shù)是由病毒引起的,檢測病毒感染的常用方法有:病毒分離培養(yǎng)最為經(jīng)典,但不利于病毒的快速診斷;血清學(xué)診斷較快,但需要已知的特異的抗原或抗體成分,而造成呼吸道感染的病毒有幾百種,目前尚不能滿足該抗原抗體需求;RT-PCR方法敏感性強(qiáng)、特異性高,在病毒的核酸檢測中具有較高的實(shí)用價(jià)值。但是傳統(tǒng)的RT-PCR法通常一次只能從標(biāo)本中檢驗(yàn)出一種病毒,對(duì)于尚不明確的病毒感染無異于大海撈針。xMAP技術(shù)平臺(tái)是一種高效的分子檢測手段,它的靈敏性、特異性及可重復(fù)性都得到了很好的驗(yàn)證[2]。在本研究中,我們將一種新型的Tem-PCR擴(kuò)增技術(shù)和xMAP技術(shù)整合在一起,整個(gè)檢測可在4h左右完成。

MDD檢測系統(tǒng)具有多重性,提高了病毒的檢出率,在一次檢測過程中,可對(duì)多種呼吸道感染的病原體同時(shí)檢測,達(dá)到快速診斷、指導(dǎo)治療的目的[3]。從而克服常規(guī)PCR的局限性,同時(shí)具有高效、敏感、特異特點(diǎn),信息量大,可用于對(duì)呼吸道致病病原體的快速初篩,對(duì)不明原因發(fā)熱為主要特征的呼吸道癥候群協(xié)助診斷。

[1]張梓荊.小兒病毒性呼吸道感染與病毒性肺炎[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,1990:4.

[2]Inanone MA.Mierosphere-based molecular cytometry[J].Clin Lab Med,2001,21:731～742.

[3]Spiro A,Kowe M.Qunatitation of DNA sequences in environmental PCR products by a multiplexed bead-based method[J].Appl Environ Micmbiol,2002,68:1010～1013.