原發(fā)性肝細胞癌患者組織中瘦素及其受體表達與臨床病理特征的關(guān)系

蔡 俊，王宏升

(北華大學附屬醫(yī)院，吉林吉林132011)

近年研究發(fā)現(xiàn)，瘦素(leptin)及其特異性瘦素受體(OB-R)在多種腫瘤中均有異常表達，提示其表達可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切［1，2］。關(guān)于 leptin及其受體在原發(fā)性肝細胞癌(HCC)中表達情況的研究不多，并且結(jié)果報道不一［3～6］。2010年 11月～2011年4月，我們通過RT-PCR和Western blot方法檢測HCC及癌旁組織中l(wèi)eptin及OB-R mRNA和蛋白的表達，并分析其與臨床病理特征之間的關(guān)系，旨在為進一步研究leptin及其受體與HCC的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料 HCC標本33例，癌組織及癌旁組織標本均取自術(shù)中，先切取癌旁組織(距腫瘤邊緣5 cm)，再切取癌組織。將取下的標本迅速切成0．3 cm×0．3 cm×0．3 cm大小裝入凍存管中，經(jīng)液氮速凍后保存于液氮罐中。標本均經(jīng)病理證實，并記錄臨床資料，包括年齡、性別、HBV感染、血清AFP水平、腫瘤大小、TNM分期等。其中男30例、女3例，年齡22 ～70(48．5 ±12．9)歲。

1．2 方法

1．2．1 RT-PCR檢測mRNA表達 取肝癌及癌旁組織 30 mg，用 RNeasy Mini kit(Qiagen，Valencia，CA)提取組織總RNA并用紫外分光光度計方法定量，用High Capacity RNA-to-cDNA Kit進行cDNA合成(Applied Biosystems，USA)。取 cDNA 200 ng，用AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems，USA)進行目的基因的PCR擴增。引物序列及產(chǎn)物大小如下:leptin上游引物5'-TTCTTGTGGCTTTGGCCCTA-3'，下游引物 5'-GGAGACTGACTGCGTGTGTGAAA-3'，132 bp;OB-R上游引物 5'-TGTTGTGAATGTCTTGTGCC-3'，下游引物 5'-TACTCCAGTCACTCCAGATTCC-3'，394 bp。β-actin 為內(nèi)參照檢測cDNA合成質(zhì)量。

1．2．2 Western blot檢測蛋白表達 肝癌及癌旁組織勻漿，裂解液裂解后蛋白定量。取50 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，用電轉(zhuǎn)儀將蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，二抗孵育1 h，ECL化學發(fā)光法顯色，壓片曝光、顯影。leptin、OB-R和 β-actin抗體均購自Santa Cruz公司，通過預實驗確定一抗?jié)舛取?/p>

1．2．3 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS13．0軟件包進行統(tǒng)計學處理，采用χ2檢驗，以P≤0．05為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2．1 leptin及 OB-R mRNA表達 見圖 1。leptin mRNA在癌和癌旁組織中的陽性率分別為66．7%(22/33)和87．9%(29/33);OB-R mRNA 在癌和癌旁組織中的陽性率分別為57．6%(19/33)和84．8%(28/33)。leptin及OB-R mRNA在癌旁組織中的陽性表達率均高于癌組織(P＜0．05)。

圖1 leptin和OB-R mRNA在HCC中的表達

2．2 leptin及OB-R蛋白表達 見圖2。leptin蛋白在癌和癌旁組織中的陽性率分別為63．6%(21/33)和81．8%(27/33);OB-R蛋白在癌和癌旁組織中的陽性率分別為 48．5%(16/33)和 75．8%(25/33)。leptin和OB-R蛋白在癌旁組織中的陽性表達率均高于癌組織(P ＜0．05)。

圖2 leptin和OB-R蛋白在HCC中的表達

2．3 與臨床病理特征的關(guān)系 對leptin和OB-R在肝癌中的表達與臨床病理參數(shù)，包括年齡、性別、HBV感染、血清AFP水平、腫瘤大小、臨床分期等進行了統(tǒng)計學分析，結(jié)果顯示leptin和OB-R的表達與臨床病理特征無顯著相關(guān)性(P＞0．05)。

3 討論

leptin主要通過與外周組織器官表達的OB-R相結(jié)合發(fā)揮其生物學效應(yīng)。以往研究顯示，leptin與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，但是其作用是促進還是抑制腫瘤仍然存在分歧。有研究認為leptin、OB-R可促進細胞增殖與分化，可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起促進作用;也有研究者認為，leptin、OB-R在腫瘤免疫中發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。因此，leptin可能對于不同組織類型的腫瘤細胞具有不同的生物學作用。

leptin和OB-R在生物學功能方面的雙重作用已經(jīng)越來越多的引起學者們的關(guān)注，對于leptin和OB-R在HCC中的表達情況報道不一。為明確leptin和OB-R在HCC患者癌和癌旁組織中的表達情況，我們采用更為靈敏的RT-PCR和Western blot方法分別檢測leptin和OB-R mRNA和蛋白的表達，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，leptin和OB-R在癌旁組織中表達率均高于癌組織，兩者有顯著性差異，這與Wang等［3］應(yīng)用免疫組化方法對leptin和OB-R在HCC癌和癌旁組織中的表達研究結(jié)果一致。我們還對leptin和OB-R的表達與患者年齡、性別、HBV感染、血清AFP水平、腫瘤大小和TNM分期等臨床病理參數(shù)的關(guān)系進行了分析，統(tǒng)計學分析結(jié)果未見顯著性差異。

綜上所述，HCC及癌旁組織中均存在著leptin以及OB-R的雙重表達。其對于肝癌發(fā)生發(fā)展過程中可能的機制還需要我們在未來的研究中繼續(xù)深入探討。

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