非諾貝特對糖尿病大鼠主動脈組織中Trx mRNA表達的影響

王 云，劉 謙，秦明照，任 潔，劉 琦

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院，北京100730)

高血糖引起的氧化應(yīng)激不僅增加脂質(zhì)過氧化，而且增強血管炎癥反應(yīng)，是加速糖尿病動脈粥樣硬化的重要因素［1］。硫氧還蛋白(Trx)作為氧化應(yīng)激的一個生物標(biāo)志物，可以從一個方面反應(yīng)機體氧化應(yīng)激水平，同時Trx上調(diào)具有抗氧化的作用［2，3］。有研究表明過氧化物酶體增生物激活受體α(PPARα)激活可使Trx表達上調(diào)，而核內(nèi)易位的Trx可抑制PPARα的活性［4］，在生理條件下二者形成一個負反饋環(huán)。高血糖刺激下應(yīng)用PPARα激動劑對Trx的表達影響如何，相關(guān)報道較少。2009年10月～2010年6月，本研究通過檢測Trx在糖尿病大鼠主動脈組織中的表達，應(yīng)用PPARα激動劑非諾貝特進行藥物干預(yù)，觀察此藥對Trx表達的影響，探討糖尿病大鼠大動脈組織中氧化應(yīng)激水平變化，藥物對抗氧化應(yīng)激的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇體質(zhì)量180～200 g雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(級別SPF/VAF)，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，12 h光照周期，自由進食水。普通飼料喂養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機分為對照組(C組，n=10)和實驗組，對照組予普通飼料喂養(yǎng)，實驗組給予高脂高糖飼料［5］(20% 糖 +2.5% 膽固醇 +10% 脂肪，67.5 %常規(guī)普通飼料)喂養(yǎng)4周后造模。

1.2 試劑 鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma-Aldrich公司);檸檬酸和檸檬酸鈉(北京化學(xué)試劑廠)，10%水合氯醛(北京同仁醫(yī)院制劑室)，非諾貝特膠囊(法國利博福尼制藥公司惠贈)，TRIzol(美國Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)，SYBR Green PCR Master Mix(英國ABI公司)。

1.3 糖尿病大鼠模型建立 禁食12 h后，實驗組于腹腔注射STZ(45 mg/kg)行糖尿病大鼠造模。5 d后應(yīng)用剪尾法取血測血糖，血糖值＞16.7 mmol/L即為造模成功［5］，納入本實驗，每周監(jiān)測血糖、體質(zhì)量。隨機分為糖尿病組(A組，n=10)和藥物干預(yù)組(B組，n=10)，A組給予蒸餾水灌胃，B組給予非諾貝特100 mg/(kg·d)，共灌胃8周。實驗過程中A組死亡2只，B組死亡1只。

1.4 標(biāo)本采集 全部大鼠采血前均禁食不禁水3 h，稱重后應(yīng)用10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉，采用頸靜脈插管取血約3 ml，置于不含抗凝劑真空采血管中，靜置后離心(3 000 r/min)5 min，分離出血清。留取主動脈弓、胸主動脈組織標(biāo)本于－80℃凍存。

1.5 大鼠生化指標(biāo)測定 應(yīng)用美國Beckman公司Unicel DxC 800型全自動生化分析儀測定血糖，血脂各項包括甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)。

1.6 大鼠主動脈Trx mRNA表達水平檢測 每只大鼠分別取主動脈組織約100 mg(于－80℃凍存)，總RNA以TRIzol提取，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用實時定量PCR儀(英國ABI公司ABI7300)行實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)檢測各組Trx mRNA水平。應(yīng)用Primer express軟件設(shè)計引物(美國Applied Biosystem公司)，引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成，Trx上游引物F:5'-TCCAATGTGGTGTTCCTTGA-3';下游引物 R:5'-ATAGAACTGGAAGGTCGGCA-3'。18s上游引物F:5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3';下游引物 R:5'-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3'。反應(yīng)參數(shù):50℃ 2 min，1個循環(huán);95℃ 2 min，1個循環(huán);95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，50個循環(huán);95 ℃ 15 s，60 ℃30 s，95℃ 15 s，1個循環(huán)。18s rRNA作為cDNA定量的內(nèi)參。以管家基因18 s為內(nèi)參，計算出每個目的基因mRNA的相對含量，該值越高，表明目的基因在該模板的表達量越高。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件，計量資料應(yīng)用±s表示。各組資料首先進行正態(tài)性分布檢驗，非正態(tài)分布的計量資料分別取In對數(shù)轉(zhuǎn)換。多組間變量比較采用單因素方差分析(ANOVA)，對ANOVA有統(tǒng)計學(xué)差異的變量進一步采用LSD進行兩兩組間比較。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量、血糖情況比較 見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、血糖情況比較

2.2 各組大鼠血脂水平比較 單因素方差分析顯示，血脂各項中各組TC、TG差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。各組 LDL、HDL差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。進一步行組間比較，結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠血脂水平比較(mmol/L)

2.3 各組大鼠主動脈組織中Trx mRNA表達比較A、B、C組大鼠Trx mRNA表達水平分別為46.24、79.11、9.68，P ＜0.05。進一步行組間比較，A 組、B組Trx mRNA表達水平高于C組(P＜0.05)，B組高于A 組(P ＜0.05)。

3 討論

貝特類藥物是一類人工合成的PPARα的配體，也可以稱為PPARα的藥理性激動劑。臨床上非諾貝特主要用于治療混合性高脂血癥和高三酰甘油血癥。PPARα在肝臟和腎臟中表達量很高，同時在心肌和血管組織中也有表達。激活的PPARα可以介導(dǎo)載脂蛋白apoA-1表達，促進脂蛋白脂肪酶合成，并通過對一些目的基因表達的調(diào)控，使脂肪酸、TG和極低密度脂蛋白合成減少［6］。

本研究給予大鼠非諾貝特100 mg/(kg·d)干預(yù)，8周后檢測血清TC、TG、HDL及LDL水平，結(jié)果顯示TC、TG較對照組和糖尿病組無明顯減低，但可明顯降低LDL，同時升高HDL，這一結(jié)果與Ye等［7］的一致。本實驗中未能看到其降低TC、TG的作用，考慮與高脂高糖飲食抑制大鼠食欲，減少其進食量有關(guān)，在造模前實驗組動物體質(zhì)量比對照組降低也證實此推論。但非諾貝特降低大鼠LDL，升高HDL的作用在本實驗中是肯定的。

已有多個臨床試驗及動物實驗證實貝特類藥物在調(diào)脂同時還可以減低心血管事件的發(fā)生［8，9］，延緩動脈粥樣硬化進程［10］。這些作用不僅與其降低血脂有關(guān)，而且與其參與目的基因表達的調(diào)控有關(guān)。研究證實，在Trx的遠端啟動子區(qū)有一段過氧化物酶激活物反應(yīng)元件(PPRE)，激活的核受體PPARRXR異二聚體同這段序列發(fā)生特異性結(jié)合，進而激活Trx基因轉(zhuǎn)錄，激活 PPARα能上調(diào) Trx的表達［4］。近期也有研究報道，在單核細胞衍生的巨噬細胞中PPARα特殊的啟動子GW647可以上調(diào)Trx基因表達。上述研究均在細胞水平上進行，迄今在體動物實驗關(guān)于PPARα對Trx表達調(diào)控的研究報道較少。本研究通過在體動物實驗觀察了非諾貝特對糖尿病大鼠主動脈組織中Trx mRNA表達的影響。結(jié)果顯示，非諾貝特可以上調(diào)Trx mRNA表達水平，與對照組和糖尿病組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

到目前為止，已發(fā)現(xiàn)至少有60個轉(zhuǎn)錄因子的活性受到氧化還原環(huán)境的影響。Trx通過對蛋白氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)，在體內(nèi)調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，如:抗氧化轉(zhuǎn)錄因子Nrf2、雌激素受體、糖皮質(zhì)激素受體等轉(zhuǎn)錄活性。Trx對轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控決定了Trx對基因表達的影響。在細胞內(nèi)過表達Trx能增強炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)的血紅素加氧酶的表達，從而起到細胞保護作用。另外應(yīng)用重組Trx處理細胞也能調(diào)控某些基因的表達。Das等應(yīng)用小劑量Trx即可顯著誘導(dǎo)SOD的表達，Kontou等［11］發(fā)現(xiàn)還原型Trx能上調(diào)GAPDH和IKB的mRNA水平。可以推測Trx對轉(zhuǎn)錄因子及基因表達的調(diào)控在高糖氧化應(yīng)激損傷及糖尿病大血管病變中可能具有非常重要的作用。本研究觀察到非諾貝特可以上調(diào)大鼠主動脈組織中Trx mRNA表達水平，提示PPARα激動劑對心血管的保護效應(yīng)是通過上調(diào)Trx的基因表達，從而影響Trx介導(dǎo)的一系列基因的轉(zhuǎn)錄活性，以發(fā)揮其抗氧化、抗炎、抑制炎癥因子生成的作用［12］，這也可以解釋非諾貝特具有調(diào)脂外的抗動脈粥樣硬化的作用。

本研究非諾貝特可以上調(diào)主動脈組織中Trx mRNA表達，但我們沒有觀察非諾貝特對血清Trx的影響，而且不同劑量的非諾貝特或其他PPARα激動劑是否影響血清Trx水平有待在今后的工作中進一步研究。這些推論還需要進一步的研究加以證實和探討。

［1］Brownlee M.The pathobiology of diabetic complications:a unifying mechanism［J］.Diabetes，2005，54(6):1615-1625.

［2］Berk BC.Novel approaches to treat oxidative stress and cardiovascular diseases［J］.Trans Am Clin Climatol Assoc，2007，118:209-214.

［3］Billiet L，F(xiàn)urman C，Cuaz-Pérolin C，et al.Thioredoxin-1 and its natural inhibitor，vitamin D3up-regulated protein 1，are differentially regulated by PPARalpha in human macrophages［J］.J Mol Biol，2008，384(3):564-576.

［4］Liu GH，Qu J，Shen X.Thioredoxin-mediated negative autoregulation of peroxisome proliferator-activated receptor alpha transcriptional activity［J］.Mol Biol Cell，2006，17(4):1822-1833.

［5］Zhou YS，Gao Y，Guo XH，et al.Effects of timely insulin treatment on protection of beta cells in a rat model of type 2 diabetes mellitus［J］.Chin Med J(Engl)，2004，117(10):1523-1529.

［6］Duval C，Müller M，Kersten S.PPARalpha and dyslipidemia［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1771(8):961-971.

［7］Ye JM，Doyle PJ，Iglesias MA，et al.Peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR)-alpha activation lowers muscle lipids and improves insulin sensitivity in high fat-fed rats:comparison with PPAR-gamma activation［J］.Diabetes，2001，50(2):411-417.

［8］Tenenbaum A，Motro M，F(xiàn)isman EZ，et al.Bezafibrate for the secondary prevention of myocardial infarction in patients with metabolic syndrome［J］.Arch Intern Med，2005，165(10):1154-1160.

［9］Keech A，Simes RJ，Barter P，et al.Effects of long-term fenofibrate therapy on cardiovascular events in 9795 people with type 2 diabetes mellitus(the FIELD study):randomised controlled trial［J］.Lancet，2005，366(9500):1849-1861.

［10］Sacks FM.The relative role of low-density lipoprotein cholesterol and high-density lipoprotein cholesterol in coronary artery disease:evidence from large-scale statin and fibrate trials［J］.Am J Cardiol，2001，88(12A):14N-18N.

［11］Kontou M，Will RD，Adelfalk C，et al.Thioredoxin，a regulator of gene expression［J］.Oncogene，2004，23(12):2146-2152.

［12］Dragomir E，Tircol M，Manduteanu I，et al.Aspirin and PPAR-alpha activators inhibit monocyte chemoattractant protein-1 expression induced by high glucose concentration in human endothelial cells［J］.Vascul Pharmacol，2006，44(6):440-449.