肺脹陽虛水泛證動(dòng)物模型的建立方法

韋袞政 和菊花 劉濤 錢銳 張馨予 儲(chǔ)麗英 祁向榮

肺脹是中醫(yī)學(xué)對(duì)多種肺系疾病所致肺氣脹滿、不能斂降的一類疾病的總稱，相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)。既往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可以形成慢性支氣管炎、肺氣腫、肺心病、心衰各階段動(dòng)物模型。本病證的特點(diǎn)是氣道有慢性炎癥改變、肺氣腫和右心衰同時(shí)存在。以往的造模處理因素比較單一，與本病證復(fù)雜的臨床病理實(shí)際差距較大，擬建立造模因素與臨床病理因素相類似、病理改變與臨床特征更相符的病證模型，形成慢性氣道炎癥、肺氣腫和右心衰的統(tǒng)一體，形成肺脹陽虛和水泛的統(tǒng)一體。本實(shí)驗(yàn)從肺脹的病機(jī)出發(fā)，借鑒以往的造模經(jīng)驗(yàn)，建立肺脹陽虛水泛證動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

動(dòng)物：SD大鼠，雌雄各半，體重200～250 g，許可證號(hào)：SCXK(滇)2005-0008，由昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑與儀器

脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)，Sigma公司產(chǎn)品，型號(hào)L2880，規(guī)格10 mg，批號(hào)055∶B5。野百合堿(Crotaline)，Sigma公司產(chǎn)品，型號(hào)C2401，規(guī)格500 MG，批號(hào)119K1579。氫化可的松，天津金耀氨基酸有限公司產(chǎn)品，國(guó)藥準(zhǔn)字H12020886，規(guī)格25 mg/5 ml。阿霉素(鹽酸多柔比星)，浙江海正藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，國(guó)藥準(zhǔn)字H33021980，批號(hào)100301，規(guī)格10 mg/瓶。芙蓉牌過濾嘴香煙，湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司出品，焦油量：12 mg/支。西門子超聲心動(dòng)圖儀型號(hào)SEQUOIA512，探頭型號(hào)15L8W-S。自制雙層鐵架80 cm×50 cm×50 cm，外套可上下移動(dòng)的透明薄膜，頂膜開通直徑1.5 cm通氣圓孔6個(gè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組：選取健康合格實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠64只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組10只；氫化可的松對(duì)照組12只；阿霉素對(duì)照組12只；阿霉素低劑量組15只；阿霉素高劑量組15只。造模過程是連續(xù)的，大體上分為4個(gè)階段。

1.3.2 建立慢性支氣管炎、肺氣腫模型階段：氫化可的松對(duì)照組、阿霉素對(duì)照組、阿霉素低劑量組分別于實(shí)驗(yàn)第1、21天氣管內(nèi)每次注入LPS各0.2 mg(0.1 ml)；阿霉素高劑量組分別于實(shí)驗(yàn)第1、21、51天氣管內(nèi)每次注入LPS各0.2 mg(0.1 ml)，空白對(duì)照組分別于實(shí)驗(yàn)第1、21天氣管內(nèi)注入生理鹽水0.1 ml/次。氣管內(nèi)注入脂多糖方法：1%苯巴比妥鈉80 mg/kg腹腔注射，麻醉后，暴露喉頭，以靜脈套管針替代氣管導(dǎo)管行氣管插管，向大鼠氣管內(nèi)注入LPS 0.2 mg，完畢后將大鼠垂直旋轉(zhuǎn)10～20秒，使LPS均勻分布于肺部。自實(shí)驗(yàn)開始的90天內(nèi)，除氣管內(nèi)注入藥物、肌肉注射或腹腔注射藥物的當(dāng)天外，其余時(shí)間均將大鼠置于密閉透明塑料薄膜箱內(nèi)，箱下小鐵架上點(diǎn)燃香煙，拉下塑料薄膜罩住煙霧，香煙用量30支/(m3·15min)，每次連續(xù)30分鐘，每天1次?？瞻讓?duì)照組置正常空氣中呼吸。

1.3.3 建立肺動(dòng)脈高壓模型階段：實(shí)驗(yàn)第61天造模大鼠腹腔內(nèi)一次性注射2%野百合堿溶液，氫化可的松對(duì)照組、阿霉素對(duì)照組、阿霉素低劑量組60 mg/kg，阿霉素高劑量組70 mg/kg?？瞻讓?duì)照組一次性腹腔注射生理鹽水2 ml。

1.3.4 建立陽虛模型階段：實(shí)驗(yàn)第63天起造模大鼠臀部肌肉注射0.5%注射氫化可的松，阿霉素對(duì)照組、阿霉素低劑量組每次20 mg/kg，阿霉素高劑量組每次30 mg/kg，每天下午1次，連續(xù)7天?？瞻讓?duì)照組、氫化可的松對(duì)照組大鼠臀部肌肉注射生理鹽水1 ml。

1.3.5 建立右心衰模型階段：實(shí)驗(yàn)第71天開始造模大鼠腹腔注射1‰阿霉素每次2 mg/kg，每周1次，低劑量組共6次，累計(jì)用量為12 mg/kg，高劑量組共8次，累計(jì)用量16 mg/kg?？瞻讓?duì)照組、阿霉素對(duì)照組每次腹腔注射生理鹽水2 ml，每周1次，共6次。

1.4 一般觀察

觀測(cè)大鼠的一般情況：心率、呼吸狀態(tài)、體重、飲食、精神、活動(dòng)動(dòng)作、姿態(tài)、毛發(fā)、鼻色、眼瞼、喘鳴、咳嗽、皮膚、下肢、爪、大便、小便等。

1.5 檢測(cè)項(xiàng)目

1.5.1 心臟超聲心動(dòng)圖檢測(cè)

各組于煙熏前、氫化可的松肌肉注射結(jié)束后第1天、阿霉素腹腔注射結(jié)束后第7天(阿霉素對(duì)照組同阿霉素低劑量組、空白對(duì)照組同阿霉素高劑量組)，分別行心臟超聲心動(dòng)圖檢查。先行1%苯巴比妥鈉80 mg/kg腹腔注射，麻醉后胸腹區(qū)備皮，仰臥位固定，采用超聲心動(dòng)圖儀，14 MHz高頻探頭，標(biāo)準(zhǔn)胸骨旁左室長(zhǎng)軸、短軸、心尖四腔切面，測(cè)量左心室舒張末期內(nèi)徑(LV-Diastole)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LV-Systole)、射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.5.2 測(cè)量尿量

各組于煙熏前、氫化可的松肌肉注射結(jié)束后第2、3天、阿霉素腹腔注射結(jié)束后第8、9天(阿霉素對(duì)照組同阿霉素低劑量組、空白對(duì)照組同阿霉素高劑量組)，分別收集大鼠自由飲水情況下和禁水情況下24小時(shí)尿量。

1.5.3 探查內(nèi)臟

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，頸椎旋轉(zhuǎn)法處死大鼠，切開胸腹腔，觀察心包、心臟、肺臟、胸水、腹水情況，從環(huán)狀軟骨上緣切斷氣管，修去脂肪，取出心和肺，沿心臟外緣剪去大血管，濾紙吸去血液，觀察肺臟、心臟、心包表面情況，稱量心、肺重量(包括氣管)，計(jì)算肺臟與體重、心臟與體重的比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 癥狀

動(dòng)物一般情況：煙熏開始時(shí)大鼠憋氣、咳嗽、亂竄，尋找地方躲藏，10分鐘后開始汗出、流涕，乏力，繼而靜止不動(dòng)，停止煙熏、正?？諝夂粑箝_始活躍。氣管內(nèi)注入脂多糖后1小時(shí)內(nèi)，大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重刺激性咳嗽、呼吸困難。煙熏30天后大鼠精神欠佳，活動(dòng)減少，時(shí)有咳嗽，毛發(fā)煙黃色。2個(gè)月后出現(xiàn)偶有喉間哮鳴音，呼吸急促，消瘦。肌肉注射氫化可的松后第2天即出現(xiàn)畏寒、弓背、縮身、體毛枯疏蓬松等肺陽虛表現(xiàn)。注射阿霉素后期大鼠精神極度萎靡，行動(dòng)遲緩，咳嗽加重，呼吸急促，畏寒，弓背、縮身，體毛枯疏蓬松無光澤，瞇眼，極度消瘦，納食減少，尿量減少等衰竭表現(xiàn)。阿霉素高劑量組衰竭表現(xiàn)較重，阿霉素對(duì)照組無衰竭表現(xiàn)。氫化可的松對(duì)照組無陽虛表現(xiàn)?？瞻讓?duì)照組則活潑好動(dòng)，體肥，皮毛亮澤緊密色白，無明顯咳嗽、氣促、納差、尿少等表現(xiàn)。

2.2 尿量變化

從預(yù)實(shí)驗(yàn)的觀察中得知，在自由飲水情況下，部分大鼠的尿量過多，組內(nèi)差別相當(dāng)大，與飲水量明顯相關(guān)，而在禁水情況下，組內(nèi)懸殊明顯縮小。末次大鼠正常飲水和禁水情況下24小時(shí)平均尿量見表1。

末次大鼠24小時(shí)尿量在自由飲水情況下，阿霉素高劑量組、阿霉素低劑量組與空白對(duì)照組相比有顯著性差異；在禁水情況下，阿霉素高劑量組與空白對(duì)照組相比有顯著性差異。

表1 末次大鼠24小時(shí)尿量

2.3 超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果

氫化可的松階段大鼠心臟擴(kuò)大不顯著，阿霉素注射后大鼠心肌肥厚、心臟擴(kuò)大、心功能下降，高劑量組更為顯著。各組左心室舒張末期內(nèi)徑、收縮末期內(nèi)徑及射血分?jǐn)?shù)超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果見表2-3。

末次阿霉素對(duì)照組、氫化可的松對(duì)照組大鼠左心室舒張末期內(nèi)經(jīng)、左心室收縮末期內(nèi)經(jīng)、射血分?jǐn)?shù)與空白對(duì)照組相比無顯著性差異。末次阿霉素高劑量組、阿霉素低劑量組大鼠左心室舒張末期內(nèi)經(jīng)、射血分?jǐn)?shù)與空白對(duì)照組相比有顯著性差異，末次阿霉素高劑量組大鼠左心室收縮末期內(nèi)經(jīng)與空白對(duì)照組相比有顯著性差異，末次阿霉素高劑量組大鼠射血分?jǐn)?shù)與阿霉素低劑量組相比有顯著性差異。

表2 末次大鼠心臟超聲檢測(cè)結(jié)果

表3 實(shí)驗(yàn)前后各組大鼠心臟超聲檢測(cè)結(jié)果

氫化可的松對(duì)照組大鼠左心室舒張末期內(nèi)經(jīng)前后相比有顯著性差異。阿霉素對(duì)照組、阿霉素低劑量組、阿霉素高劑量組大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑、左心室收縮末期內(nèi)徑、射血分?jǐn)?shù)實(shí)驗(yàn)前后相比有顯著性差異。

2.4 腹腔臟器表現(xiàn)

成模后部分大鼠出現(xiàn)心包積液、胸腔積液、腹腔積液，腹腔積液量多達(dá)8 ml，以阿霉素高劑量組為多見。部分大鼠出現(xiàn)肺臟瘀血斑點(diǎn)，少數(shù)出現(xiàn)心臟瘀血斑點(diǎn)，空白對(duì)照組無內(nèi)腔積液、瘀血表現(xiàn)。肺臟與體重、心臟與體重的比值相比無顯著性差異。見表4。

表4 大鼠肺臟重量、心臟重量與體重的比值

2.5 成模率

預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，大鼠高劑量(每次50 mg/kg)氫化可的松肌肉注射后立即死亡的1只，第2天死亡2只，正式實(shí)驗(yàn)時(shí)減少氫化可的松劑量。隨著阿霉素劑量的增加，死亡率相對(duì)增高。本實(shí)驗(yàn)總死亡率在20%左右。經(jīng)過香煙反復(fù)熏吸、氣管內(nèi)注入脂多糖后大鼠肺脾氣虛證的成模率達(dá)90%以上，氫化可的松肌肉注射后陽虛證成模率達(dá)100%，按形成心包積液、胸腔積液、腹腔積液計(jì)算，阿霉素高劑量組陽虛水泛證成模率達(dá)40%。

3 討論

肺脹是中醫(yī)病名，在《靈樞經(jīng)·脹論》中已有記載，“肺脹者，虛滿而喘咳”[1]。肺脹陽虛水泛證是肺脹的一個(gè)證型，漢代《金匱要略·水氣病脈證并治》云：“咳而喘，不渴者，此為肺脹，其狀如腫[2]”，嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)“咳逆倚息，短氣不得臥，其形如腫”的癥狀，這就是肺脹陽虛水泛證。COPD以氣流受限不完全可逆為特征，以肺功能檢查為指標(biāo)，臨床上以咳、痰、喘為表現(xiàn)。肺脹同樣以咳、痰、喘、甚則腫為主要表現(xiàn)，肺脹與COPD 不完全相等，但大部分重疊。從癥狀上看，肺脹陽虛水泛證與COPDⅣ期(極重度)伴右心衰癥狀相似。右心衰的水泛屬陰水性質(zhì)，右心衰的本質(zhì)屬陽虛范疇，與腎、脾、心陽虛有關(guān)。

COPD是多因素誘發(fā)的一種疾病，病情的發(fā)展多數(shù)經(jīng)歷了慢性支氣管炎、肺氣腫、肺動(dòng)脈高壓、肺心病、心衰的過程。許多學(xué)者模擬COPD的病理變化和臨床特征，對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行了多項(xiàng)研究。如利用煙熏法建立肺氣腫動(dòng)物模型[3]。采用煙熏40天加氣管內(nèi)注入脂多糖(LPS)的方法可以成功制備COPD模型[4]。野百合堿可引起肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、肺血管重建，導(dǎo)致肺心病肺動(dòng)脈高壓[5,6]。在研究陽虛的模型中，以皮質(zhì)激素模型為最多、最可靠[7]。應(yīng)用阿霉素腹腔注射，累計(jì)劑量24 mg/kg，6周后可形成心衰模型[8]。

本實(shí)驗(yàn)基于重癥COPD的病理過程，應(yīng)用多種致病因素，復(fù)合造模。通過序貫應(yīng)用香煙反復(fù)熏吸、氣管內(nèi)注入脂多糖、野百合堿腹腔注射、氫化可的松肌肉注射及阿霉素腹腔注射，可以引起大鼠心臟擴(kuò)大、心肌肥厚、左心室舒張期末內(nèi)徑增大、左心室收縮期末內(nèi)徑增大、左心室射血分?jǐn)?shù)下降，嚴(yán)重時(shí)形成心包積液、胸腔積液、腹腔積液改變。從表現(xiàn)來看，形成了肺脹陽虛水泛證動(dòng)物模型。肺脹陽虛水泛證動(dòng)物模型的形成是多種因素的累積效應(yīng)，香煙反復(fù)熏吸、氣管內(nèi)注入脂多糖、野百合堿腹腔注射可形成肺脹肺脾氣虛型動(dòng)物模型；在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用氫化可的松肌肉注射，可以形成肺脹陽虛證；繼續(xù)應(yīng)用阿霉素腹腔注射，可以形成肺脹陽虛水泛證，與臨床常見的重癥慢性阻塞性肺疾病表現(xiàn)相類似?？焖俪霈F(xiàn)陽虛癥狀的因素是氫化可的松，引起陽虛水泛的關(guān)鍵因素應(yīng)是阿霉素，因單用野百合堿腹腔注射未見到水泛現(xiàn)象，如果是重疊效應(yīng)，仍以阿霉素高劑量組多見。在人體，水泛多表現(xiàn)在下肢部位，顯而易見。而在爬行動(dòng)物，四肢肌肉血管較少，下肢水液墜積不顯著，較難形成下肢水腫現(xiàn)象，水液容易積聚在胸腹部。實(shí)驗(yàn)中氫化可的松肌肉注射后大鼠較快死亡的原因有待進(jìn)一步探討。通過形態(tài)觀察、腹腔探查、心臟超聲心動(dòng)圖檢查等，可以認(rèn)為該實(shí)驗(yàn)形成了肺脹陽虛水泛證動(dòng)物模型。該模型煙熏時(shí)間長(zhǎng)，心功能下降顯著，是一種有效的肺脹陽虛水泛證動(dòng)物模型造模方法。

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