成人慢性ITP患者外周血NKT細胞的檢測

王菊梅，鄭昭璟，馬擁軍，胡英萍，徐瑞龍，3

（1.衢化醫(yī)院 檢驗科，浙江 衢州 324004；2.金華市中心醫(yī)院 檢驗科，浙江 金華 321000；3.溫州醫(yī)學院 檢驗醫(yī)學院，浙江 溫州 325035）

特發(fā)性血小板減少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP）是一種以1型T細胞反應為主的自身免疫性疾病，以外周血血小板（PLT）計數(shù)持續(xù)減少為特征。ITP患者體內(nèi)存在活化的PLT抗原特異性自身反應性T細胞，能識別自體PLT抗原并誘導B細胞產(chǎn)生自身抗體，與PLT結合從而導致網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞系統(tǒng)（reticular-endot-helial system，RES），尤其是脾臟破壞PLT是PLT減少的主要原因[1-3]。

自然殺傷T（natural killer T，NKT）細胞是機體內(nèi)存在的一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細胞亞群，以表達恒定的T細胞受體（T-cell receptor，TCR）Vα24鏈和Vβ11鏈為特征[4]。NKT細胞數(shù)量和功能的變化與多種人類自身免疫性疾病的發(fā)病有關，但相關機制仍未充分闡明[5]。本研究對慢性ITP患者外周血NKT數(shù)量進行分析，初步探討其在成人慢性ITP中的意義。

1 資料和方法

1.1 研究對象 本研究共收集金華市中心醫(yī)院慢性ITP患者68例，選取年齡、性別匹配的同期健康體檢者38例作為對照組（見表1）。慢性ITP的診斷標準參見文獻[6]，即PLT數(shù)＜50×109/L并持續(xù)6個月以上；骨髓巨核細胞數(shù)量正?；蛟龆?，無任何病態(tài)造血形態(tài)學表現(xiàn)；除外任何繼發(fā)的免疫性或非免疫性可以引起PLT減少的其他疾病。所有患者和健康志愿者在標本采集前2周內(nèi)均未進行激素治療或其他可以影響PLT代謝的藥物。所有慢性ITP患者均處于活動期。臨床上一般將PLT計數(shù)小于20×109/L作為預防性PLT輸注以降低臨床出血風險的標準。因此，我們根據(jù)患者PLT計數(shù)的多少，將慢性ITP患者按照PLT計數(shù)分為兩組：即PLT＜20×109/L組（30例）和＞20×109/L組（38例），以研究調(diào)節(jié)性T細胞在慢性ITP發(fā)病中可能發(fā)生的作用。

表1 慢性ITP患者與健康對照組一般資料比較

1.2 儀器和試劑 流式細胞儀為Beckman-Coulter Epics XL，流式試劑：CD3-PE-Cy5、Flow-check、IgG1-FITC、IgG2a-PE、Vα24-FITC、Vβ11-PE（Beckman-Coulter，USA)；血細胞分析儀為Sysmex XE-2100及配套試劑；Lympho-Prep密度梯度分離液（Cat#1114545，Axis-Schield，Norway）。

1.3 外周血單個核細胞的分離 慢性ITP組和健康對照組均靜脈穿刺采集EDTA-K2抗凝血6 mL以等量0.9%氯化鈉溶液稀釋后置于6 mL Lympho-Prep密度梯度分離液置水平離心機以離力（RCF）約800 g室溫離心20 min；以毛細滴管吸取介于分離液和血漿層之間的單個核細胞轉(zhuǎn)移至另外一根試管內(nèi)，加入等量0.9%氯化鈉溶液300 g室溫繼續(xù)離心10 min，去上清，以pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞，重復3次；最后以pH 7.4 PBS重懸細胞并調(diào)節(jié)細胞濃度為5×106/mL（PBMNC）待用。

1.4 TCRvα24+vβ11+NKT的檢測 采用三色流式細胞術（FCM）進行NKT細胞的檢測。取兩根12 mm×75 mm流式試管分別標記同型對照和測試管；吸取10μL CD3-PE-Cy5至試管底部，在同型對照管中加入IgG1-FITC（PN IM0639U）和IgG2a-PE（PN A09141）各20μL，在測試管中加入Vα24-FITC（PN IM1589）和Vβ11-PE（PN IM2290）各20μL；每管中均加入100μL的PBMNC，漩渦振蕩混勻后避光、室溫孵育15 min；每管中加入pH 7.4 PBS 2 mL混勻；置水平離心機350 g室溫離心5 min；棄上清，加0.5 mL PBS重懸細胞、待測。見圖1-2。

應用Flow-check進行光路和流路校正以確保儀器正常運行。利用ADC Expo32軟件進行數(shù)據(jù)獲取和分析。以SSC/FSC結合SSC/CD3設門圈定CD3+細胞分析其中Vα24+Vβ11+占CD3+的百分比即為NKT細胞的水平。每個測試至少檢測100000個CD3+細胞。

1.5 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS 16.0和GraphPad Prism 4.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。兩組比較采用獨立樣本t檢驗；多組比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊性兩兩比較采用LSD法，方差不齊兩兩比較采用Donnett T3法；非參數(shù)檢驗采用Pearson卡方；相關分析采用線性回歸法完成。

圖1 流式細胞術分析成人慢性ITP和健康對照組PBMNCs中的NKT細胞。分別以前向（FSC）/側(cè)向（SSC）光散射信號（A）和SSC/CD3（B）設門分析CD3+細胞TCRVα24和TCRVβ11的表達。以同型對照設定CD3+細胞表達TCRVα24和TCRVβ11的閾值（C）。成人慢性ITP患者（D）和健康對照組（E）PBMNCs中NKT細胞的數(shù)量以NKT細胞（CD3+Vα24+Vβ11+）占 CD3+的百分比表示并進行比較（F）。

圖2 PLT計數(shù)＜20×109/L、＞20×109/L的慢性成人ITP患者及健康對照組外周血NKT細胞數(shù)量的比較（A）；慢性成人ITP患者外周血NKT細胞數(shù)量與PLT計數(shù)的線性回歸分析曲線（實線）和95%可信區(qū)間（點狀線），r=-0.373；P=0.033（B）。

2 結果

2.1 ITP患者和健康對照外周血NKT細胞水平 慢性ITP組PBMNCs中NKT細胞的比例為0.13%±0.03%，高于對照組的0.07%±0.01%，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（見圖1）。但PLT計數(shù)＜20×109/L的慢性ITP患者組NKT為0.22%±0.05%，顯著高于健康對照組的0.07%±0.01%（P＜0.05）和PLT計數(shù)＞20×109/L的慢性ITP患者組的0.05%±0.01%（P＜0.05），而后兩組間NKT細胞水平的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 ITP患者外周血NKT細胞與PLT計數(shù)的關系 慢性ITP和對照組間NKT細胞的分布差異無統(tǒng)計學意義，但PLT計數(shù)＜20×109/L的慢性ITP組中NKT細胞水平顯著高于另外兩組。慢性ITP組外周血NKT細胞水平與血小板計數(shù)間的關系的直線回歸分析結果：慢性ITP患者外周血PLT計數(shù)與NKT細胞水平間存在負相關，相關系數(shù)r=-0.373，P=0.033（見圖 2）。

3 討論

ITP的發(fā)病機制是因機體失去對自身PLT抗原的外周耐受，自體免疫細胞識別自身PLT抗原、產(chǎn)生自身反應性T細胞和自身抗體，從而導致PLT的異常破壞，外周血PLT計數(shù)持續(xù)減少。目前認為NKT和Tregs細胞是機體維持外周耐受最為重要的兩種免疫調(diào)節(jié)細胞。Johansson等[7]發(fā)現(xiàn)ITP患者外周血NKT細胞的增殖潛力比健康對照組顯著減低、NKT細胞減少，而且這種增殖潛力的降低在激素治療后變得更加顯著，因此推測NKT細胞在ITP發(fā)病機制中發(fā)揮作用?；罨腘KT細胞能通過IL-2依賴機制調(diào)節(jié)Tregs細胞的功能，而Tregs細胞能通過細胞接觸依賴機制抑制NKT細胞的增殖、細胞因子分泌和細胞毒活性[8]。Johannson等[9]在1例女性ITP患者中發(fā)現(xiàn)外周血中出現(xiàn)NKT細胞的顯著增高，并且這種增加的NKT細胞能夠抑制自體CD4+細胞的體外增殖活性，推測NKT細胞在ITP患者中具有保護作用。他們的這一觀點得到Ho等[10]結果的支持。Ho等發(fā)現(xiàn)活化的NKT細胞抑制CD8+細胞的體外增殖，并且發(fā)現(xiàn)CD8+NKT細胞通過殺傷抗原提呈細胞的機制限制T細胞的活化。本研究發(fā)現(xiàn)：與對照組比較，ITP患者外周血NKT細胞數(shù)量較高但差異無統(tǒng)計學意義。進一步分析得知，ITP患者外周血NKT細胞數(shù)量依PLT數(shù)量減少程度的不同而有顯著差異，即PLT數(shù)量＜20×109/L的慢性ITP患者組NKT細胞數(shù)量顯著高于健康對照組和PLT計數(shù)＞20×109/L的慢性ITP患者組的NKT數(shù)量，而后兩者間的差異仍無統(tǒng)計學意義。本研究還發(fā)現(xiàn)ITP患者外周血NKT細胞與PLT間在數(shù)量上存在負相關關系（r=-0.373，P=0.033），這進一步支持NKT細胞在ITP中發(fā)揮作用的觀點。

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