復(fù)方降糖茶對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的治療作用及其可能機(jī)制

張瑩瑩，于捷，周旋，王雙虎，紀(jì)永軍，潘建春（溫州醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035）

糖尿病是一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝性疾病，主要分為I型和II型糖尿病。許多臨床資料表明，中草藥對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥有獨(dú)特的療效，但因其成分復(fù)雜，作用機(jī)制尚不甚明確[1-4]。本課題以復(fù)方降糖茶為研究藥物，通過(guò)以鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠為模型給予復(fù)方降糖茶治療4周，觀察其降糖效果。同時(shí)，從抗氧化應(yīng)激、調(diào)血脂以及胰島組織形態(tài)測(cè)定三方面探討復(fù)方降糖茶的降糖作用機(jī)制，以及復(fù)方降糖茶改善胰島功能、提高糖尿病大鼠胰島素敏感性（ISI）及降血糖的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Wistar大鼠40只，6～7周齡，體重150～180 g，由溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)sysxk浙2005-0061）。

1.2 主要藥品與試劑 復(fù)方降糖茶制劑由溫州循證醫(yī)學(xué)研究所提供（湯劑），主要成分為郁金、茯苓、黃芪、合歡皮、黨參、珍珠母、白芍、甘草、牡蠣等九味藥材組成濃縮至每毫升相當(dāng)于0.5 g生藥；二甲雙胍；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程公司）；STZ（Sigma公司）；強(qiáng)生穩(wěn)步血糖儀（強(qiáng)生公司）。

1.3 動(dòng)物模型制備 分組與給藥：Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為4組，即正常對(duì)照（NC）組，糖尿病造模（DM-C）組，陽(yáng)性對(duì)照二甲雙胍（DM-M）組，復(fù)方降糖茶（DM-JTC）組，每組10只，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物間體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用司曉晨等[5]方法，稍作修改，明暗周期12 h/12 h，自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，NG組、DM-C組、DM-M組和DM-JTC組均喂高糖高脂飼料（基礎(chǔ)飼料73%、糖15%、膽固醇2%、煉豬油10%，自行配置），共計(jì)4周。然后DM-C組、DM-M組和DM-JTC組按30mg·kg-1劑量腹腔內(nèi)注射STZ（溶于0.1 mmol·L-1檸檬酸緩沖液，pH 4.4）。造模成功后，各組開(kāi)始喂基礎(chǔ)飼料至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.4 給藥方式 DM-JTC組按臨床成人劑量即5 g·kg-1灌胃給藥，共計(jì)4周。DM-M組按200 mg·kg-1灌胃給予，共計(jì)4周。NC組和DM-C組灌胃給予相同體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.5 血清空腹血糖（FBG）、空腹血胰島素（Fins）、血清總膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）和低密度脂蛋白（LDL-C）的測(cè)定 各組大鼠于4周末隔夜禁食后，主動(dòng)脈采血，37 ℃溫浴10 min，3000 r·min-1離心10 min，取上清500μL。日立7170全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定FBG、TC、TG、HDLC和LDL-C。Fins用放射免疫分析法檢測(cè)。ISI=1/（Fins×FBG）。

1.6 血清SOD和MDA活性測(cè)定 按SOD和MDA試劑盒操作說(shuō)明分別測(cè)定其含量。

1.7 肝腎組織勻漿SOD和MDA活性測(cè)定 取血后迅速在冰盒上解剖，取出肝臟和腎臟，4 ℃ 0.9%氯化鈉溶液沖洗表面的血污，拭干。稱取組織塊1 g，加入9 mL生理鹽水，剪碎，研磨，分別制備10%肝勻漿和腎勻漿，3000 r·min-1離心12 min，上清液置4 ℃冰箱中待用?？捡R斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量。SOD活性測(cè)定：將上述勻漿液稀釋成1%勻漿，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定；MDA活性測(cè)定：10%勻漿，用TBA比色法測(cè)定。

1.8 胰腺組織HE染色 多聚甲醛灌注后，立即摘取大鼠胰腺，取部分組織常規(guī)脫水，包埋，切片，染片后，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察，拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 組間差異采用Dunnett’s t-test（two-sides）。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方降糖茶對(duì)糖尿病大鼠體重增長(zhǎng)的影響 注射STZ 1周后，即給藥前，DM-C組大鼠體重顯著降低（P<0.01），之后，隨造模時(shí)間的延長(zhǎng)，體重進(jìn)一步降低（P<0.01）。與DM-C組比較，給予復(fù)方降糖茶治療21 d后，能顯著抑制體重減輕的趨勢(shì)（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 復(fù)方降糖茶對(duì)糖尿病大鼠體重的影響（±s，n=10，g）

表1 復(fù)方降糖茶對(duì)糖尿病大鼠體重的影響（±s，n=10，g）

與NC組比：##P<0.01；與DM-C組比：*P<0.05

組別 處理前 7d 14d 21d 28d DM-C 311±9.2 290±7.5## 276±12.4## 257±14.0## 249±10.5##DM-JTC 317±8.3 287±7.3 281±10.5 279±11.6* 274±16.0*DM-M 314±10.7 293±11.5 279±15.2 270±18.0 265±16.7*NC 315±7.2 346±10.1 365±26.2 373±19.1 382±20.5

表2 復(fù)方降糖茶對(duì)糖尿病大鼠血糖的影響（±s，n=10，mmol·L-1）

表2 復(fù)方降糖茶對(duì)糖尿病大鼠血糖的影響（±s，n=10，mmol·L-1）

與NC組比：#P<0.05，##P<0.01；與DM-C組比：**P<0.01

組別 處理前 處理后DM-C 9.23±1.31# 25.43±7.93##DM-JTC 9.33±1.15 13.13±5.56**DM-M 9.26±1.65 15.23±4.66**NC 5.73±0.82 5.20±0.97

2.2 復(fù)方降糖茶對(duì)糖尿病大鼠FBG和ISI的影響

造模后，與NC組比較，DM-C組血糖顯著升高（P<0.05）。給予復(fù)方降糖茶后，與DM-C組比較，血糖顯著降低（P<0.01），見(jiàn)表2。對(duì)于ISI，造模后，與NC組比較，DM-C組ISI顯著降低（P<0.01），給予復(fù)方降糖茶治療4周后，ISI有所回升（P<0.05），接近NC組水平，見(jiàn)表3。

2.3 復(fù)方降糖茶對(duì)糖尿病大鼠血脂的影響 與NC組比較，DM-C組大鼠的TC、TG、LDL-C水平顯著升高（P<0.01或P<0.05），HDL-C含量降低（P<0.05）。降糖茶治療后，糖尿病大鼠TC、TG、LDL-C均有下降的趨勢(shì)，與DM-C組比，TC和LDL-C的降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表3。

表3 復(fù)方降糖茶對(duì)糖尿病大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、ISI的影響（±s，n=10，mmol·L-1）

表3 復(fù)方降糖茶對(duì)糖尿病大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、ISI的影響（±s，n=10，mmol·L-1）

與NC組比：#P<0.05，##P<0.01；與DM-C組比：*P<0.05，**P<0.01

組別 TC TG HDL-C LDL-C ISI DM-C 2.45±1.08## 0.81±0.25# 0.56±0.17# 1.63±0.05## -5.54±0.24##DM-JTC 1.88±0.17* 0.67±0.15 0.66±0.11 1.20±0.04* -4.88±0.62*DM-M 1.82±0.30* 0.37±0.06** 0.71±0.20* 1.14±0.07* -4.98±0.35*NC 1.38±0.16 0.56±0.26 0.75±0.16 0.95±0.03 -4.55±0.33

2.4 復(fù)方降糖茶對(duì)糖尿病大鼠血清、肝腎SOD活性的影響 與NC組比較，DM-C組大鼠血清及肝腎組織SOD活性顯著降低（P<0.01）；給予復(fù)方降糖茶后，DM-JTC組大鼠的血清及肝腎組織SOD活性明顯提高（P<0.05或P<0.01）。DM-M組血清及肝腎組織SOD活性也有一定程度的升高。見(jiàn)表4-5。

2.5 復(fù)方降糖茶對(duì)糖尿病大鼠血清、肝腎MDA活性的影響 與NC組比，DM-C組大鼠血清及肝腎組織MDA活性顯著升高（P<0.01或P<0.05）；給予復(fù)方降糖茶后，DM-JTC組大鼠血清及肝腎組織中MDA水平顯著降低（P<0.05）。DM-M組糖尿病大鼠組織中的MDA水平變化不大。見(jiàn)表4-5。

表4 復(fù)方降糖茶對(duì)糖尿病大鼠血清SOD和MDA含量的影響（±s，n=10）

表4 復(fù)方降糖茶對(duì)糖尿病大鼠血清SOD和MDA含量的影響（±s，n=10）

與NC組比：##P<0.01；與DM-C組比：*P<0.05

組別 SOD（U/mgprot） MDA（nmol/mgprot）DM-C 201.16±6.12## 12.75±1.20##DM-JTC 236.59±10.56* 9.17±1.12*DM-M 211.33±9.56 10.71±1.24 NC 263.85±5.89 7.63±1.42

表5 復(fù)方降糖茶對(duì)糖尿病大鼠肝臟和腎臟SOD、MDA活性的影響（±s，n=10）

表5 復(fù)方降糖茶對(duì)糖尿病大鼠肝臟和腎臟SOD、MDA活性的影響（±s，n=10）

與NC組比：#P<0.05，##P<0.01；與DM-C組比：*P<0.05，**P<0.01

組別 肝臟SOD(U/mgprot) 肝臟MDA(nmol/mgprot) 腎臟SOD(U/mgprot) 腎臟MDA(nmol/mgprot)DM-C 369.53±32.34## 5.96±0.47# 494.80±34.49## 3.98±0.32#DM-JTC 407.53±30.71** 4.52±0.76* 562.49±45.40** 3.34±0.33*DM-M 397.28±36.15* 4.98±0.90 559.34±40.72** 3.58±0.41 NC 423.67±26.64 4.31±0.55 599.08±41.80 2.65±0.50

2.6 復(fù)方降糖茶對(duì)糖尿病大鼠胰腺組織的影響 光鏡下，NC組大鼠胰島數(shù)目較多，呈現(xiàn)圓形或橢圓形細(xì)胞團(tuán)狀，邊界清楚；胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)目較多，排列整齊，胞漿豐滿，核多為圓形。糖尿病大鼠與正常組比較：胰島萎縮，胰島邊緣皺縮，與周?chē)M織邊界不清；胰島細(xì)胞核大小、形態(tài)不規(guī)則，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)下降；治療組與DM-C組比較：病理改變均減輕，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)目增多，體積增大，外觀基本正常。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠胰腺組織HE染色結(jié)果（×40）

3 討論

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的中草藥中的大黃、卷柏、水飛薊、黃芪、黃連素、夏枯草、葛根、苡仁等，以及加味桃核承氣湯、黃連解毒湯、三黃煎等復(fù)方有較好的抗IR作用。復(fù)方降糖茶由黃芪、牡蠣等中藥組成，系師承秘方，具有健脾、平肝、補(bǔ)腎的功效，臨床上用于高血壓、高脂血癥、糖尿病的治療，療效確切。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）產(chǎn)生過(guò)多或消除減少，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。有文獻(xiàn)報(bào)道，ROS可以損傷胰島β細(xì)胞，此外，氧化應(yīng)激增強(qiáng)是糖尿病慢性并發(fā)癥的主要發(fā)病機(jī)制之一[6-10]。無(wú)論是I型還是II型糖尿病中都發(fā)現(xiàn)有活性氧簇和自由基的增加[11]。這可能是因?yàn)樘悄虿〔∪嘶驅(qū)嶒?yàn)動(dòng)物模型持續(xù)存在的慢性高血糖導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而導(dǎo)致抗氧化防御系統(tǒng)的功能耗竭，氧自由基水平升高[12]。高水平的自由基攻擊以及伴隨的抗氧化酶相對(duì)低表達(dá)，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能異?；蚱渌?xì)胞器損傷[13]。

本研究中也觀察到了相似的結(jié)果，糖尿病大鼠血清和肝腎組織中MDA水平顯著升高，而SOD活性顯著降低。補(bǔ)充給予復(fù)方降糖茶后，大鼠體內(nèi)MDA水平顯著降低，SOD水平顯著升高，提示復(fù)方降糖茶能預(yù)防或保護(hù)組織器官免受自由基的損害。

另一方面，糖尿病大鼠由于胰島素生物活性不足，激素敏感性脂肪酶活性增加，產(chǎn)生葡萄糖利用障礙，抗脂解作用降低，血糖和TC、TG、LDL-C水平增加，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生糖毒性和脂毒性作用，引起機(jī)體多種功能受損[14]。復(fù)方降糖茶在降血糖的同時(shí)，可改善糖尿病大鼠的一般情況，抑制體重減輕，同時(shí)顯著降低糖尿病大鼠TC、TG、LDL-C含量，升高HDL-C含量。這可能是隨著胰島β細(xì)胞的修復(fù)，胰島素分泌增多從而改善糖代謝和脂代謝，是脂肪酶合成增加，血脂降低有關(guān)。但其對(duì)血脂調(diào)節(jié)作用較陽(yáng)性對(duì)照藥物二甲雙胍弱。

近10年來(lái)，醫(yī)學(xué)界對(duì)二甲雙胍的藥理作用和它在臨床治療糖尿病中的一些優(yōu)點(diǎn)逐漸有了新的認(rèn)識(shí)，特別是它在改善胰島素抵抗方面的作用，是磺脲類降糖藥所沒(méi)有的[15]。本實(shí)驗(yàn)以二甲雙胍為陽(yáng)性對(duì)照，胰島素敏感指數(shù)測(cè)試顯示，與DM-M組比較，復(fù)方降糖茶能更好地改善機(jī)體的胰島素敏感性，這也提示了其改善糖尿病病人的耐糖量和高胰島素血癥的作用。

因此，復(fù)方降糖茶可以改善糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)，保護(hù)胰島細(xì)胞，糾正血糖及血脂代謝紊亂，并顯著提高胰島素敏感指數(shù)，對(duì)糖尿病的治療及其并發(fā)癥的防治具有一定的作用。但其具體的降血糖途徑和胰島細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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