直腸癌中腫瘤/睪丸抗原相關(guān)基因的表達(dá)

梁 爽,王曉華,趙艷明,楊 華

(1.河北工程大學(xué) 醫(yī)學(xué)院,河北 邯鄲056029;2.邯鄲市中心醫(yī)院 神經(jīng)外一科,河北 邯鄲056000)

腫瘤/睪丸抗原(cancer-testis antigen,CTA)是一類腫瘤特異性抗原,只在腫瘤中表達(dá),在正常組織(睪丸和胎盤除外)中均不表達(dá),因而成為腫瘤疫苗研究中最有價(jià)值的一類抗原。目前有關(guān)這一類抗原在直腸癌中的聯(lián)合表達(dá)情況報(bào)道較少。我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法(SP法)對(duì)68例不同臨床分期的直腸癌患者腫瘤組織中多種CTA的表達(dá)進(jìn)行了檢測,以期為CTA疫苗用于直腸癌患者的免疫治療提供理論依據(jù),并檢驗(yàn)CTA的表達(dá)率與臨床分期的關(guān)聯(lián)性。

1 材料和方法

1.1材料68例直腸癌標(biāo)本均選自我院附屬醫(yī)院病理科2003-04/2008-11臨床資料完整的存檔蠟塊,均為直腸腺癌,20例癌旁正常腸黏膜作對(duì)照。瘤體及癌旁正常組織均有病理切片證實(shí)。全部病例術(shù)前均無化療、放療及免疫治療史。其中高分化癌29例,中分化癌17例,低分化癌22例。按照Dukes分期,A期20例,B期18例,C期21例,D期9例;伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例。男性41例,女性27例;年齡22-78歲(平均56歲)。

1.2免疫組織化學(xué)檢測所有標(biāo)本均經(jīng)10%的中性福爾馬林固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋,4 μ m連續(xù)切片,分別作HE和SP染色。濃縮型鼠抗人MAGE-1單克隆抗體、鼠抗人NY-ESO-1單克隆抗體、鼠抗人SCP-1單克隆抗體均購自Upstate公司、SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司。SP染色按試劑盒說明操作,3%雙氧水室溫孵育5-10 min除去內(nèi)源性過氧化物酶的活性,微波修復(fù)抗原15 min(800 V),常規(guī)免疫組化標(biāo)記。以正常睪丸組織作為陽性對(duì)照;用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。DAB顯色,蘇木精襯染,中性樹膠封固,顯微鏡觀察。

1.3結(jié)果判斷及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)免疫組化染色陽性反應(yīng)為在細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒。光鏡雙盲法下觀察切片,每個(gè)標(biāo)本切片取10個(gè)高倍視野。結(jié)果判定采用Sinicrope 1995年首次應(yīng)用的由Tanaka于2000年改良的定量記分法[1]:選取5個(gè)代表不同區(qū)域,觀察5個(gè)400倍高倍視野,計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù),計(jì)算陽性細(xì)胞百分率和評(píng)定顯色強(qiáng)度。依照陽性細(xì)胞百分率小于5%為0分,5—25%為1分,25—50%為2分,50—75%為3分,大于75%為4分;依照顯色強(qiáng)度未顯色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分,兩項(xiàng)得分相乘,并取5個(gè)高倍視野得分的平均值。按照分?jǐn)?shù)分為4個(gè)等級(jí),即0-1為(-)陰性,2-4分為(+)低表達(dá),5-8分為(++)中表達(dá),9分以上為(+++)高表達(dá)。為了減少人為因素造成的判斷誤差,由兩名高年資病理醫(yī)師逐一觀察同一切片,以兩人觀察結(jié)果核對(duì)后作為最終評(píng)定結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理檢測數(shù)據(jù)輸入SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,各組間比較用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CTA在癌旁正常腸黏膜中的表達(dá)

MAGE-1、NY-ESO-1和SCP-1在正常直腸組織中無表達(dá);MAGE-1、NY-ESO-1和SCP-1蛋白陽性表達(dá)定位于直腸癌的細(xì)胞質(zhì)。

2.2 CTA在直腸癌中的表達(dá)及與比較(表1)

在檢測的68例直腸癌標(biāo)本中,MAGE-1的陽性表達(dá)率為30.9%(21/68)、NY-ESO-1的陽性表達(dá)率為23.5%(16/68)、SCP-1的陽性表達(dá)率為17.6%(12/68)。

2.3 CTA在直腸癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(表1)

CTA在不同病理分級(jí)的直腸癌中表達(dá)具有不均一性。MAGE-1、NY-ESO-1和SCP-1在不同病理分級(jí)的直腸癌中表達(dá)有差別(P＜0.05),其表達(dá)主要集中在分化較好的Ⅰ級(jí)直腸癌中,而與年齡、性別、Dukes分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P＞0.05)。

2.4 直腸癌中CT抗原的共同表達(dá)

68例直腸癌標(biāo)本中至少表達(dá)一種CTA的為46例,占總數(shù)的67.6%(46/68);同時(shí)表達(dá)兩種或兩種以上CTA的為14例,占總數(shù)的20.6%(14/68),同時(shí)表達(dá)三種CTA的僅有4例,占總數(shù)的5.9%(4/68)。

表1 CTA在直腸癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

目前,直腸癌的治療仍采用手術(shù)切除結(jié)合放、化療,但患者痛苦大,術(shù)后轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)較常見,因此,針對(duì)腫瘤特異性抗原的免疫治療已成為臨床治療研究的熱點(diǎn)。以腫瘤特異性抗原作為免疫原,誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答,是腫瘤免疫治療的基礎(chǔ)。CTA能同時(shí)引起機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫[2],被認(rèn)為是目前免疫原性最強(qiáng)的腫瘤抗原之一而備受關(guān)注[3-9]。

目前,國內(nèi)外研究大多采用RT-PCR的方法檢測CT基因有表達(dá),蛋白水平的研究尚不多見。Masaki等報(bào)道在 54例大腸癌標(biāo)本中MAGE-1、-2、-3的表達(dá)為30%、28%、20%[10]。本組研究應(yīng)用免疫組化的方法檢測68例直腸癌中MAGE-1蛋白,陽性率為30.9%(21/68)。該研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致。另外本實(shí)驗(yàn)檢測出NY-ESO-1、SCP-1的陽性表達(dá)率分別為 23.5%(16/68)、17.6%(12/68)。而在正常直腸黏膜中未檢測到MAGE-1、NY-ESO-1及SCP-1蛋白,進(jìn)一步證實(shí)CTA只在腫瘤組織中表達(dá)的特性,同時(shí)表明了該基因在腫瘤診斷中有一定的價(jià)值。上述結(jié)果提示這三種CTA在直腸癌中有高度特異性表達(dá),從而使得利用這三種CTA作為腫瘤疫苗用于直腸癌患者的特異性免疫治療成為可能。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,MAGE-1、NY-ESO-1及SCP-1的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期均無關(guān),但三者在不同病理分級(jí)的直腸癌中表達(dá)均有差別,主要集中在高分化的I級(jí)腫瘤細(xì)胞,而Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)腫瘤細(xì)胞之間無明顯差別,這可能與樣本例數(shù)較少有關(guān),雖然其分子機(jī)制尚待進(jìn)一步探討,但這一結(jié)果提示含有以上三種CTA的腫瘤疫苗更適合用于高分化的直腸癌。目前研究表明CTA雖表達(dá)于多種腫瘤組織,但其陽性率均偏低。因此單價(jià)的CTA瘤苗用于免疫治療顯得過于單薄。本實(shí)驗(yàn)中,MAGE-1、NY-ESO-1、SCP-1在直腸癌中的陽性率分別為30.9%(21/68)、23.5%(16/68)、17.6%(12/68),其中有 46例至少表達(dá)一種CTA,占總數(shù)的67.6%(46/68),有14例表達(dá)兩種或兩種以上CTA,占總數(shù)的20.6%(14/68),同時(shí)表達(dá)三種CTA的僅有4例,占總數(shù)的5.9%(4/68),這就為采用多價(jià)瘤苗進(jìn)行免疫治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。由此,我們可以推測聯(lián)合三種CTA制備的多價(jià)瘤苗可以用于67.7%的直腸癌患者的免疫治療。

綜上所述,聯(lián)合本實(shí)驗(yàn)中的三種CTA更適合用于高分化直腸癌的免疫治療,并為多效價(jià)CTA疫苗的應(yīng)用提供理論依據(jù),這不僅可以使更多的腫瘤患者得到治療,還可有效避免因腫瘤抗原表達(dá)的個(gè)體差異和抗原調(diào)變所致的免疫逃逸[11],為直腸癌的主動(dòng)免疫治療提供一種合適、有效的攻擊靶點(diǎn)。

[1]Tanaka K,Iwamooto S,Gon G,et al.Expression of survivin and its relationship to loss of apopotosis in breast carcinomas[J].Clin Cance Res,2000,6(1):127.

[2]CostaFF,Le Blanc K,Brodin B.Cancer/Testis antigens,stem cells and cancer[M].Stem Cells,2006:30.

[3]ScanlanMJ,Simp son AJ,Old LJ.The cancer/testis genes:review,standardization,and commentary[J].Cancer Immun,2004,23(4):1.

[4]Van der Bruggen P,T raver Sari C,Chomez P,et al.A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma[J].Science,1991,254(5038):1643.

[5]劉彬彬,葉勝龍,賀 平,等.修飾的樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)殺傷人肝癌細(xì)胞[J].中華肝臟病雜志,2001,9(3):151.

[6]Zhao Y,Zheng Z,Khong HT,et al.Transduction of an HLA-DP4-restricted NY-ESO-1-specific TCR into primary human CD4+lymphocytes[J].J Immunother,2006,29,(4):398.

[7]Tureci O,DahinU,Koslow skiM,et al.Identification of a meiosis-specific protein as a new member of the class of cancer/testis antigens[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95:5211.

[8]TureciO,DAHIN U,KoslowskiM,et al.Identification of a meiosis-specific protein as a new member of the class of cancer/testis antigens[J].Proc Natl Acad Sci U SA,1998,95:5211.

[9]Matthew J Scanlan,Ali O Gure,A chim A Jungbluth,et al.Cancer/testis antigens:an expanding family of targets for cancer immunotherapy[J].Immunological Review s,2002,188:22.

[10]Masaki Mori,Inoue H,Mimori K et al.Expression of MAGE genes in human colorectal carcinoma[J].Ann Surg,1996,224:183.

[11]趙 輝,沈晨陽,王丹蕾,等.腫瘤睪丸抗原(CTA)在肺癌中的表達(dá)[J].中國肺癌雜志,2002,5(5):330.