巢式PCR檢測血清中煙曲霉基因的實驗研究

李芳秋,周萬青,王立魁,史利寧,邵海楓

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院·解放軍臨床檢驗醫(yī)學研究所,江蘇南京210002)

曲霉菌屬已成為免疫功能低下患者致命性感染的重要致病因子。其易感人群包括中性粒細胞減少癥、同種異體造血干細胞移植或肺移植、HIV感染晚期以及遺傳性免疫缺陷癥患者。侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis,IA)的確診或臨床診斷需要病原學依據(jù),由于血培養(yǎng)陽性率極低,曲霉特異性診斷標志缺乏,使得病原學診斷困難,阻礙著及時、有效的治療[1]。擴增曲霉特異性基因(通常為編碼核糖體RNA的基因)的PCR診斷方法,已經(jīng)在侵襲性曲霉病的診斷中顯示出良好的應用前景[2、3]。本實驗將利用煙曲霉播散性感染動物模型,取不同感染時段外周血分別進行PCR測定和曲霉培養(yǎng),考查巢式PCR對侵襲性曲霉感染的早期診斷的可行性。還檢測了25例臨床患者外周血中煙曲霉基因,并與GM試驗結果比較,評價巢式PCR方法在IA診斷中的價值。

1 材料和方法

1.1主要試劑及儀器Taq DNA聚合酶及dNTPs(Promega公司),蛋白酶K(Merck公司),E.Z.N.A.Fung DNA Kit(Omega公司),100bp DNA Marker(Fermentas公司);PlateliaTM Aspergillus EIA GM Kit(Bio-Rad公司);PCR擴增儀及紫外分光光度計(Eppendorf公司),凝膠成像分析系統(tǒng)(捷達公司)。

1.2實驗動物及主要藥物新西蘭白兔由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院實驗動物中心提供,體重2.5-3.5 Kg,雌性,1只/籠,常規(guī)飼養(yǎng)。注射用氫化可的松,天津金耀氨基酸有限公司,批號:0710312;注射用頭孢他啶,廣州白云山天心制藥股份有限公司,批號:080801。

1.3菌株及分生孢子的制備煙曲霉(A1株,由中科院皮膚病研究所饋贈)接種SDA斜面培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)4天,用含0.5%Tween-20的生理鹽水沖洗菌落獲得分生孢子,并在旋渦振蕩器上劇烈振蕩使成單個孢子,離心收集上清中單個孢子懸液。用細胞計數(shù)板計數(shù)孢子濃度并調整為(1-5)×109/ml。

1.4實驗動物分組及處理[4](1)動物分組:對照組,正常兔1只,未免疫抑制,未接種煙曲霉。實驗組,侵襲性煙曲霉感染兔3只,接受免疫抑制,接種煙曲霉。(2)免疫抑制處理:接種前兩天,每只兔子肌肉注射氫化可的松10 mg/Kg/天,接種當天和接種后三天給予同等劑量的氫化可的松。實驗期間,每只兔子肌肉注射頭孢他定70 mg/Kg/天,預防細菌感染。(3)煙曲霉分生孢子接種:經(jīng)耳緣靜脈注射1×106/ml煙曲霉分生孢子懸液1 ml。(4)動物標本的采集:動物感染后隔天采集一次血液,分別進行培養(yǎng)及血清保存;患病動物瀕死前解剖,取各臟器勻漿后培養(yǎng),并分別取不同臟器進行組織病理學檢查。(5)影像學檢查:在感染后不同時期分別對感染動物進行X光攝片及CT檢查。

1.5臨床標本按照IA診斷標準[5],將25例住院病人納入研究對象,其中男性19例,女性6例,年齡21-84歲。其中,確診1例,臨床診斷12例,擬診12例,共計45份血清樣本。另收集健康體檢者血清20份。分別進行巢式PCR檢測和血清半乳甘露聚糖水平的測定。

1.6巢式PCR參照文獻[6]選取曲霉特異巢式PCR引物。外側引物:M5c 5′-AGGGCACCACAAGGCGTGGA-3′,M6b 5′-AAGAAGCCAGCGGCCCGCAA-3′,擴增產(chǎn)物 209 bp;內側引物:M5cN 5′-GACTCAACACGGGGAAACTC-3′,M6bN 5′-TAAGGGCCGAGGTCTCGTTC-3’,擴增產(chǎn)物136 bp。引物由上海英駿公司合成。PCR反應體系為20 μ l:模板 DNA 5 μ l,10× buffer(無 Mg2+)2 μ l,1 U Taq 酶,10 mM 各種dNTP,37.5 mM MgCl2,上下游引物各2.5 pmol。血液標本經(jīng)離心后收集血清,-20℃保存,標本處理步驟[7]如下 :100 μ l 血清中加入 100 μ l血清處理液(100 mM KCl,20 mM Tris·HCl,pH 8.3,5 mM MgCl2,0.2 mg/ml明膠,0.9%Tween-20),混勻,加入蛋白酶K至濃度為 60 μ g/ml,混合物置55℃水浴60 min,然后95℃10 min以滅活蛋白酶K,12 000×g,4℃離心10 min。取上清液 5 μ l進行單次擴增反應:94℃45 s,57℃1min,72℃90 s,40個循環(huán) ;取1 μ l擴增產(chǎn)物作為模板進行巢式擴增反應:94℃15 s,60℃30 s,72℃60 s,30個循環(huán)。取5 μ l反應產(chǎn)物于20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳,紫外燈下觀察,拍照。

1.7臨床標本GM測定GM測定參照說明書進行,大致如下:分別將陽性、陰性、cut-off質控品(試劑盒提供)、待檢患者血清300 ml與100 ml血清標本處理液(試劑盒提供)振蕩混勻,100℃水浴3 min,12 000×g離心10 min,分別將50 ml辣根過氧化物酶標記的EB-A2和50 ml處理后上清加入已包被有EB-A2的微孔板內,封板,37℃孵育90 min,然后用洗液洗滌5次,加入底物避光作用30 min后加入100 ml反應終止液,在Microplate Reader 550型酶標儀(Bio-Rad)450/620 nm處讀取吸光度值(A值)。以cut-off質控物A值介于0.3-0.8、陽性對照A值/cut-off質控物A值均值＞2、陰性對照A值/cut-off質控物A值均值＜0.4作為實驗在控的標準?；颊哐錑M值計算公式:患者血清A值/cut-off質控物A值均值,此值＞0.5判為陽性,否則為陰性。

1.8統(tǒng)計學處理兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗,兩樣本率比較采用 χ2檢驗,采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計,P＜0.05具有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1感染動物真菌培養(yǎng)結果感染后隔天采集血液標本接種SDA培養(yǎng)基,所有血樣培養(yǎng)結果均未生長煙曲霉;解剖采取肝、肺、腎、脾等臟器勻漿后接種SDA培養(yǎng)基,三天后均生長煙曲霉。

2.2感染動物影像和病理檢查結果在病程中多次對實驗動物進行影像學檢查。感染第11天X光攝片檢查并未發(fā)現(xiàn)明顯感染病灶;感染第17天肺部CT檢查發(fā)現(xiàn)真菌感染影像改變:肺紋理增多、紊亂,肺透亮度減低,見多發(fā)散在斑片狀致密影,呈毛玻璃樣改變。尸檢解剖取不同臟器進行HE、PAS和銀染。結果見所采集各臟器呈不同程度的炎癥反應、大量膿腫形成及壞死病灶,并可見真菌孢子及煙曲霉特征性呈45°分叉菌絲。

2.3巢式PCR結果

2.3.1曲霉引物通用性及特異性 以本院微生物室保存的4種曲霉(煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉及棒曲霉),白假絲酵母菌等5種假絲酵母菌,新型隱球菌及大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄菌、肺炎克雷柏桿菌為對象,真菌以E.Z.N.A.Fung DNA Kit提取各基因組DNA,細菌常規(guī)煮沸裂解法提取DNA。分別應用該巢式PCR進行檢測。結果顯示,該反應體系在4種曲霉中均可擴增出相應條帶(209 bp/136 bp),而其余常見真菌及細菌均為陰性。

2.3.2單次PCR和巢式PCR檢測限 分別向100 μ l健康體檢者血清中加入不同稀釋度的煙曲霉DNA,以未加煙曲霉DNA血清為陰性對照,然后經(jīng)過標本處理后用于PCR檢測。單次和巢式PCR最低檢測限分別為 6×10-10g/100 μ l和6×10-13g/100 μ l(見圖 1)。

2.3.3動物血清樣本檢測結果 兔血清經(jīng)過處理后行巢式PCR檢測,結果顯示,實驗組家兔均可檢測到陽性,而對照組家兔所有血清均未檢測到目的基因。實驗組家兔中最早可在感染的2天即可檢測陽性,并可持續(xù)數(shù)日(見表1)。

圖1 巢式PCR檢測模擬血清標本檢測限

表1 巢式PCR檢測動物模型血清標本結果

2.3.4臨床患者樣本檢測結果 25例患者共45份標本用巢式PCR檢測煙曲霉DNA以及GM測定結果見表2。1例確診IA,DNA測定和GM測定都獲得陽性結果。臨床診斷IA患者12例,22份血清,巢式PCR結果敏感性為67.7%,而GM的敏感性為58.3%,二者差異不具統(tǒng)計學意義(P＞0.05);樣本陽性率分別為59.1%和54.5%,亦不具差異性(P＞0.05)。擬診IA患者,巢式PCR和GM的敏感性分別為58%和50%,二者同樣不具統(tǒng)計學差異。在本研究所測定的全部病人標本中,巢式PCR和GM測定同時陽性和同時陰性的標本各10份,二者檢測結果的符合率為44%(20/45);14份標本巢式PCR陽性而GM陰性,占總數(shù)的31%(14/45);11份標本GM陽性而巢式PCR陰性,占總數(shù)的24%(11/45);不符合率為56%(25/45)。20份健康體檢者血清標本巢式PCR結果均為陰性,特異度100%;GM結果1份 陽性,特異度為95%。

表2 臨床標本巢式PCR和GM測定結果

3 討論

PCR方法在侵襲性曲霉感染診斷的實驗研究中顯示出較大的優(yōu)勢[2,3]。Klingspor等[2]用實時PCR檢測了1650份可疑侵襲性真菌感染標本,1330份血標本中19份(1.4%)曲霉PCR陽性,均來自17例免疫抑制病人,曲霉血培養(yǎng)均為陰性,兩例BAL培養(yǎng)證實肺曲霉感染。Benjamin等[3]對來自干細胞移植患者肺泡灌洗液標本進行了侵襲性肺曲霉的檢測,比較了實時定量PCR和GM兩種方法,其敏感性分別為67%和61%,特異度則分別為100%和98%。尤其適用于高?；颊?可避免創(chuàng)傷性診斷操作,具有快速、簡便及早期等優(yōu)點。

應該看到,PCR方法用于臨床曲霉感染的診斷,還存在一些障礙:在技術方面,由于曲霉胞壁厚實堅韌,提取DNA困難,臨床標本中即便存在曲霉孢子,也不易得到陽性結果;另一方面,由于標本采集和實驗操作過程中易受空氣中真菌的污染,也易導致假陽性的出現(xiàn)。在病人方面,由于病灶內曲霉DNA向血循環(huán)中釋放的規(guī)律及動力學尚未明了[1],不易把握陽性標本的采集時機。因此,到目前為止,測定曲霉DNA的PCR方法還未被臨床實驗室廣泛采用。

我們在成功建立煙曲霉播散性感染動物模型的基礎上,進一步評價巢式PCR在診斷中的應用價值。為了增加檢測的敏感性,本實驗選取巢式PCR方法,該法比常規(guī)PCR方法的檢測限要高出幾個數(shù)量級[6,7]。關于標本類型,我們選擇血清,因其易于采集、方便處理和保存,并有研究發(fā)現(xiàn)血清檢測限比全血要低[8]。

對動物血清標本的檢測結果顯示,接種感染的第2天即可檢測出陽性結果,并可持續(xù)數(shù)日。由于同一血樣培養(yǎng)未見曲霉生長,一方面說明檢測出的DNA并非來自接種后在血液持續(xù)循環(huán)的曲霉孢子,同時也說明巢式PCR在煙曲霉深部感染的早期診斷中具有較高的敏感性。20份標本中有4份陰性,提示煙曲霉基因釋放的不連續(xù)性,但連續(xù)檢測可避免假陰性的出現(xiàn)。部分孢子侵入到血液中首先被機體免疫細胞所識別進而破壞,釋放出其DNA;其余大部分孢子則很快隨血流分布到臟器并在其中增殖。這可能是血清PCR檢測陽性而血培養(yǎng)陰性的原因,也可理解為臨床侵襲性煙曲霉感染血培養(yǎng)陽性率極低的原因。

巢式PCR和GM實驗檢測確診IA患者1例,結果均為陽性;1例臨床診斷IA患者4次檢測結果均為陽性;另1例患者4次檢測結果前兩次陽性,后2次則為陰性,其可能是由于藥物的治療與煙曲霉基因釋放有關[1]。巢式PCR敏感度稍高于GM的敏感度,但二者之間差異不具統(tǒng)計學意義。二者檢測結果符合率達到44%,說明將二者聯(lián)合應用將有效的增強檢測的準確性。14份標本檢測結果為巢式PCR陽性而GM陰性,排除污染的可能,說明巢式PCR具有更高的診斷價值。

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