吸入一氧化氮對(duì)急性大面積肺血栓栓塞家兔血漿vWF、GPⅡb/Ⅲa和CTnI的影響

張澤明,陳寶元,葛常青,張敬國,王彥存,趙學(xué)琴

(1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 呼吸科,天津300402;2.保定市第二醫(yī)院;3.河北大學(xué)附屬醫(yī)院 呼吸科)

急性大面積肺血栓栓塞早期死亡率達(dá)45%-90%,特別是伴有并發(fā)癥患者如休克和心力衰竭的肺血栓栓塞癥病死率更高[1]。肺栓塞患者心室功能障礙的原因不是十分清楚,但肺血栓患者合并有心力衰竭時(shí),多同時(shí)伴有血漿心肌肌鈣蛋白的升高和心肌受損[2],且與臨床預(yù)后呈明顯負(fù)相關(guān)[3]。吸入一氧化氮能明顯保護(hù)心肌受損,改善臨床預(yù)后[3],目的是進(jìn)一步探討吸入一氧化氮對(duì)急性大面積肺血栓患者心肌受損保護(hù)作用機(jī)理,我們實(shí)驗(yàn)大面積肺栓塞癥家兔動(dòng)物模型,研究心肌受損時(shí),血漿心肌肌鈣蛋白、血漿血管性假血友病因子(vWF)和血小板膜表面糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa)的改變,及了解吸入一氧化氮對(duì)其影響,現(xiàn)報(bào)告如下:

1 材料和方法

1.1 材料

日本大耳白兔30只,體重2-2.8 kg,兔齡6-10個(gè)月,雌雄不限,由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,隨機(jī)分為三組,實(shí)驗(yàn)組:大面積肺血栓栓塞癥動(dòng)物模型組;對(duì)照組:本組動(dòng)物模型制作只靜脈注射生理鹽水,不注射血栓栓子:治療組:大面積肺血栓栓塞癥動(dòng)物模型后2小時(shí)吸入一氧化氮治療。每組家兔10只。

1.2 急性大面積肺栓塞癥家兔受損害心肌動(dòng)物模型的制備

在局部消毒后,經(jīng)耳緣靜脈注入烏拉坦溶液(20%)麻醉劑,注入劑量1.0 g/kg,為保護(hù)氣道以利于自主呼吸行氣管插管,成功麻醉后,常規(guī)胸前大約2 cm的橫切口,同時(shí)行機(jī)械通氣,然后分離左頸外動(dòng)脈和右頸靜脈,以及暴露并分離清楚左側(cè)股靜脈,分別自右頸動(dòng)脈和左頸靜脈插入微動(dòng)脈導(dǎo)管和自制的肺動(dòng)脈導(dǎo)管,示波器監(jiān)視肺動(dòng)脈導(dǎo)管插管全過程,依據(jù)導(dǎo)管插入的長度和示波器顯示的壓力波形綜合判斷肺動(dòng)脈導(dǎo)管頭端的位置。實(shí)驗(yàn)過程中用微量蠕動(dòng)泵經(jīng)肺動(dòng)脈導(dǎo)管間斷恒流輸入生理鹽水0.3 ml/min。經(jīng)三通管通過壓力傳感器將兩導(dǎo)管連接多道生理參數(shù)分析記錄儀,同步控制肺動(dòng)脈壓和動(dòng)脈平均壓,分離并穿刺左股靜脈插入微導(dǎo)管,隨時(shí)采血和補(bǔ)液應(yīng)用,血栓栓子制備好后裝入注射器中(5 ml),經(jīng)右測頸靜脈的肺動(dòng)脈導(dǎo)管反復(fù)注入家兔血流中,栓子注入每次0.5 ml,用生理鹽水2ml快速注入,每隔3分鐘注入一次,血栓栓子連續(xù)推注至家兔動(dòng)脈平均血壓下降至基礎(chǔ)測量值的40%,家兔低血壓狀態(tài)大約維持在55-60 mmHg,維持此狀態(tài)約40分鐘,如此認(rèn)定家兔肺血栓達(dá)到大面積肺血栓栓塞的程度,此時(shí)栓子注入停止。制備模型過程中,家兔如有明顯呼吸困難,則應(yīng)進(jìn)行短暫呼吸機(jī)機(jī)械通氣治療,采用28次/分呼吸頻率,壓力控制20 cm水柱壓力。對(duì)照組家兔動(dòng)物模型制作只靜脈注射生理鹽水,不注射血栓栓子;治療組在急性大面積肺栓塞動(dòng)物模型成功制備后2小時(shí)開始吸入一氧化氮。三組家兔同時(shí)行機(jī)械通氣,機(jī)械通氣吸入50%氧濃度。

1.3 一氧化氮吸入方法

試驗(yàn)家兔自平均動(dòng)脈壓達(dá)到基礎(chǔ)血壓的40%或出現(xiàn)、氣短、發(fā)憋呼吸困難癥狀亦即家兔肺栓塞成功后2小時(shí)后開始機(jī)械通氣,一氧化氮由N2和800×10-6g/L一氧化氮混合氣體減壓后和空氣及氧氣混合,吸入一氧化氮濃度為40×10-6g/L,距離氣管插管處1m的距離接入呼吸機(jī)管道,行有創(chuàng)機(jī)械通氣治療,壓力控制通氣模式進(jìn)行通氣,控制呼吸頻率在28次/分,壓力控制在20 cm水柱以內(nèi),呼吸機(jī)行機(jī)械通氣治療時(shí)兔吸入50%氧濃度,應(yīng)用氮氧化合物分析儀持續(xù)監(jiān)測NO2、NO濃度,試驗(yàn)整個(gè)過程高鐵血紅蛋白濃度被監(jiān)測,其水平＜0.3 g/L。

1.4 采血方法

三組動(dòng)物試驗(yàn)前氣管插管,肺血栓栓塞成功后,即動(dòng)脈平均壓達(dá)到基礎(chǔ)血壓的40%,此狀態(tài)持續(xù)大約40分鐘,在插管前、動(dòng)物模型成功后2小時(shí)、吸入一氧化氮后24小時(shí)開始抽血,同時(shí)監(jiān)測動(dòng)脈平均壓和平均肺動(dòng)脈壓。

1.5 血漿血管性假血友病因子(vWF)和血漿心肌肌鈣蛋白、血小板膜表面糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa)的測定

用儀器公司全自動(dòng)免疫分析儀(美國),微粒子化學(xué)發(fā)光法測定血漿心肌肌鈣蛋白的濃度,美國貝克曼公司提供試劑盒,GPⅡb/Ⅲa單克隆抗體為美國BectonDic kinson公司產(chǎn)品,美國BectonDic kinson公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀檢測血小板膜上GPⅡb/Ⅲa,血漿血管性假血友病因子(vWF)試劑盒購于上海太陽生物技術(shù)公司,方法嚴(yán)格按說明書操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 急性大面積肺血栓栓塞癥心肌受損動(dòng)物模型

血漿心肌肌鈣蛋白濃度于2小時(shí)開始增高,于24小時(shí)后明顯高于對(duì)照組(P＜0.05),吸入一氧化氮24小時(shí)后其濃度水平明顯下降與實(shí)驗(yàn)組比較(P＜0.05)。

急性大面積肺血栓栓塞癥家兔血栓栓塞后2小時(shí)和24小時(shí)其血漿vWF、GPⅡb/Ⅲa水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.05),吸入一氧化氮24小時(shí)后其濃度水平明顯下降與實(shí)驗(yàn)組比較(P＜0.05)。見表1。

表1 三組動(dòng)物血漿VWF(%)、GPⅡb/Ⅲa(%)和 CTnI(μ g/L)比較及吸入NO對(duì)其影響(s)

表1 三組動(dòng)物血漿VWF(%)、GPⅡb/Ⅲa(%)和 CTnI(μ g/L)比較及吸入NO對(duì)其影響(s)

△與對(duì)照組T24比較,VWF、GPⅡb/Ⅲa、CTnI其 q值和P的情況為:q值8.31、9.80、14.79 P＜0.05;V#與對(duì)照組T2比較,VWF、GPⅡb/Ⅲa、CTnI其q值和P的情況為:q值 3.75、6.20、2.01 P＜0.05;V*與試驗(yàn)組T24比較,VWF、GPⅡb/Ⅲa、CTnI其q值和P的情況為:q值6.71、4.09、3.19 P ＜0.05

觀察指標(biāo) 例數(shù)(n)對(duì)照組 試驗(yàn)組 治療組T2 T24T2 T24T2 T24 VWF(%)10 111.2±24.6 113.1±25.1 153.8±26.2#212.7±28.4△ 151.9±25.1131.8±25.4*GPⅡb/Ⅲa(%)10 2.14±0.82 2.13±0.79 14.04±6.01#23.03±6.70△ 14.15±6.40 10.4±7.1*CTnI(μ g/L)10 0.092±0.02 0.08±0.009 0.110±0.02#0.41±0.07△ 0.112±0.02 0.31±0.07*

2.2 實(shí)驗(yàn)組模型制備成功后24小時(shí)血漿心肌肌鈣蛋白與血漿vWF、GPⅡb/Ⅲa相關(guān)性分析

試驗(yàn)組模型制備成功后24小時(shí)血漿心肌肌鈣蛋白與血漿vWF1明顯正相關(guān)性(r=0.99,P＜0.01);血漿心肌肌鈣蛋白與GPⅡb/Ⅲa亦呈明顯正相關(guān)性(r=0.99,P＜0.01)。

2.3 治療組吸入一氧化氮24小時(shí)后血漿心肌肌鈣蛋白與血漿vWF、GPⅡb/Ⅲa相關(guān)性分析

治療組吸入一氧化氮24小時(shí)后血漿心肌肌鈣蛋白與血漿vWF明顯正相關(guān)性(r=0.98,P＜0.01);血漿心肌肌鈣蛋白與GPⅡb/Ⅲa亦呈明顯正相關(guān)性(r=0.98,P＜0.01)。

3 討論

本研究結(jié)果亦顯示家兔在發(fā)生大面積肺血栓栓塞后其血漿vWF和血小板膜表面蛋白GPⅡb/Ⅲa復(fù)合體增加,明顯高于對(duì)照組,且與心肌肌鈣蛋白呈明顯的正相關(guān),而心肌肌鈣蛋白是肺血栓栓塞癥心肌受損的主要指標(biāo)[8],說明血漿vWF和血小板膜表面蛋白GPⅡb/Ⅲa復(fù)合體增加在肺血栓栓塞癥家兔心肌受損過程中起著重要的作用,分析其原因:大面積肺血栓栓塞家兔,栓子在肺血管內(nèi)運(yùn)動(dòng),導(dǎo)致血管內(nèi)皮受損,使vWF大量分泌于血漿中。大量增加的vWF在肺血栓栓塞發(fā)生發(fā)展過程中存在兩個(gè)主要生理作用:①調(diào)節(jié)血小板黏附和聚集,阻止血栓的形成;②攜帶并穩(wěn)定血漿Ⅷ因子的活性。在正常狀態(tài)下,血小板以無活性形式通過肺循環(huán),且很少表現(xiàn)出與肺微循環(huán)的相互作用。當(dāng)肺栓塞發(fā)生后,肺血管的內(nèi)皮細(xì)胞受損傷,血漿血小板直接或通過vWF血漿蛋白介導(dǎo)迅速黏附到因受損血管所暴露的內(nèi)皮下成分上,且在此處迅速被激活,激活的血小板表達(dá)和釋放出大量血管活性物質(zhì)。P選擇素具有介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞或血小板活化與不同類型細(xì)胞相互黏附的功能,是目前所知的映血小板活化與釋放反應(yīng)最特異的標(biāo)志物,在啟動(dòng)和擴(kuò)增血栓形成中具有重要意義[6],血小板活化釋放的血栓素A2(TXA2)是在氧化酶作用下由花生四烯酸轉(zhuǎn)化而來的重要的肺血管活性介質(zhì)和前列腺素(PGI2)是血漿中一對(duì)保持平衡的血管活性物質(zhì)。同時(shí)大面積肺血栓栓塞導(dǎo)致家兔血漿中vWF明顯升高和缺血缺氧損害冠脈內(nèi)皮細(xì)胞,這些全身和局部因素共同作用使家兔活化血小板明顯增強(qiáng),同時(shí)冠脈內(nèi)皮細(xì)胞受損,使NO和前列腺素(PGI2)分泌減少,TXA2分泌增加,從而使冠脈血管收縮增強(qiáng),舒張減弱,這些體液因子的改變加上血小板活化使冠脈血管血栓形成,導(dǎo)致心肌缺血缺氧,從而使心肌受損壞死,血漿心肌肌鈣蛋白升高,但肺血栓栓塞后因vWF分泌增加導(dǎo)致的TXA2等血管收縮物質(zhì)的分泌增加及TXA2/PGI2的平衡失調(diào)導(dǎo)致的肺動(dòng)脈高壓亦可能是心肌受損的一個(gè)原因[9]。

本研究顯示吸入一氧化氮能明顯降低大面積肺血栓栓塞癥家兔vWF水平和血小板膜表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的表達(dá)以及心肌肌鈣蛋白的濃度,且呈明顯的相關(guān)性,其可能的機(jī)理為NO為抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞上GMP-140的表達(dá),減輕中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的粘附,保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損[10],從而降低肺血栓栓塞癥家兔vWF水平,家兔vWF水平抑制血小板聚集和活化,抑制血栓發(fā)生和發(fā)展。NO可能是通過抑制蛋白酶C(PKC)活性來抑制血小板的活化,從而下調(diào)血小板GMP-140的表達(dá)[11]。NO激活血小板內(nèi)可溶性鳥苷酸環(huán)化酶,引起血小板內(nèi)的環(huán)磷酸鳥苷迅速增加,使血小板內(nèi)Ca2+濃度降低,抑制纖維蛋白原與血小板膜表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體結(jié)合,從而降低血小板聚集功能和GMP-140的表達(dá)[12],同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)吸入NO可以直接降低血小板膜表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體。因此吸入NO降低vWF水平和血小板膜表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體,抑制血小板聚集功能阻斷血栓栓塞的多個(gè)發(fā)病環(huán)節(jié),減輕肺血栓栓塞患者的心肌受損,降低血漿心肌肌鈣蛋白的濃度。

吸入一氧化氮降低大面積肺血栓栓塞癥家兔vWF水平和血小板膜表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體,可能是導(dǎo)致吸入一氧化氮降低大面積肺血栓栓塞癥家兔心肌肌鈣蛋白的濃度水平的原因。

總之,大面積肺血栓栓塞癥時(shí)血漿vWF、血小板膜表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa明顯升高,且與心肌受損呈明顯正相關(guān),吸入NO降低其vWF、血小板膜表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa水平,是保護(hù)大面積肺血栓栓塞癥心肌受損的主要機(jī)理之一。

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