bFGF在大鼠心肌纖維化中的表達

姜鐵超,鄒穎剛,于曉艷,楊 萍*

(1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院,吉林長春130033;2.吉林大學第二醫(yī)院;3.吉林大學藥學院)

心肌纖維化(myocardial fibriosis,MF)是指在心肌細胞外基質(zhì)中膠原含量顯著升高。這種病理變化在多種心血管疾病中存在,是多種心臟疾病發(fā)展到一定階段的共同病理改變,是心肌重構的主要表現(xiàn)之一[1-5]。成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factors,FGF),又稱為肝素結合因子,是一組蛋白質(zhì)結構相關的多基因大家族。到目前為止,發(fā)現(xiàn)FGF超家族共有23個成員,分別命名為FGF1-23。本實驗旨在探討bFGF在大鼠MF中的表達。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器鹽酸異丙腎上腺素注射液(Iso),由上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn);羊抗大鼠FGF單克隆抗體,由博士德公司提供;SP-9000免疫細胞化學試劑盒,由北京中杉金橋生物技術有限公司提供;萊卡4215切片機(德國);OlympusPM-10AO全自動顯微照相裝置(日本)。

1.2實驗動物及分組雄性Wistar大鼠20只,體重180-220 g,由吉林大學實驗動物中心提供。分為正常對照組及Iso組(包括12 h,72 h及1周組),每組5只。

1.3HE組織化學染色取材經(jīng)10%福爾馬林固定30 min,常規(guī)石蠟包埋。用二甲苯脫臘10 min,用100%乙醇置換二甲苯2 min、95%乙醇置換1 min、80%乙醇置換1 min及用75%乙醇置換1 min,蒸餾水沖洗2 min。蘇木素染色5 min,自來水沖洗。鹽酸乙醇分化30 s。自來水浸泡15 min。伊紅染 2 min。常規(guī)脫水,透明,中性樹膠封閉劑封片。

1.4bFGF蛋白組織化學染色石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水。蒸餾水沖洗,PBS浸泡5 min。3%H2O2去離子水(無色液體)孵育5-10 min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。滴加試劑A(藍色液體)室溫孵育10-15 min,傾去,勿洗。滴加適當比例稀釋的一抗,4℃過夜。PBS沖洗,3 min×3次。滴加試劑B(黃色液體),室溫或37℃孵育10-15 min。PBS沖洗,3 min×3次。滴加試劑C(橙色液體),室溫孵育10-15 min。PBS沖洗,3 min×3次。DAB顯色。自來水充分沖洗。復染,脫水,透明。中性樹膠封閉劑封片。

1.5統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)以s表示,采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行方差分析。

2 結果

2.1HE與bFGF免疫組織化學染色結果正常對照組心肌排列整齊,橫紋清晰,胞核明顯,無細胞腫脹。注射Iso 12 h后,心肌出現(xiàn)較多點狀壞死。注射Iso 1周后,出現(xiàn)界限清晰、多發(fā)散在壞死灶,壞死灶內(nèi)有旺盛的成纖維細胞增生,并可見一定量的膠原纖維。圖1。

Fig.1 The observation results of HE under light microscope(×400).A:control group;B:Iso 12 h;C:Iso 1 w.

2.2Masson三色染色結果

在注射 Iso12 h后,膠原量即明顯增加(P＜0.01),此后,膠原量逐漸增加,藍染面積擴大且顏色加深,且膠原排列紊亂,直至 1 w達到高峰。bFGF免疫組織化學染色結果顯示,正常對照組中可見呈淺黃色或棕褐色陽性物質(zhì)。注射Iso 12 h后,bFGF陽性物質(zhì)表達明顯增加,具體結果見表1及圖2,3。

Fig.2 The observation results of Masson under light microscope(×400).D:control group;E:Iso12 h;F:Iso 1 w

Fig.3 The observation results of bFGF under light microscope(×400).D:control group;E:Iso 12 h;F:Iso1 w

表1 注射 Iso后 NF-κ B表達

3 討論

近幾年研究發(fā)現(xiàn),FGF有幾種異構體,在動脈硬化灶中起作用的主要是bFGF(basic fibroblast growth factor),bFGF可以由內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞分泌。它的作用是促進內(nèi)皮細胞的游走和平滑肌細胞的增殖,不能使平滑肌細胞游走。能夠促進新血管形成,修復損害的內(nèi)皮細胞。FGF被認為是病灶形成促進因子,但從修復角度看它也有有利的一面。酸性成纖維細胞生長因子(acidic FGF,aFGF)又稱為FGF1,是FGF家族中最早的成員之一,其對來源于中胚層和神經(jīng)外胚層的細胞具有廣泛的生物學效應。bFGF對實驗大鼠心肌缺血再灌注損傷的心肌有保護作用。bFGF是心血管系統(tǒng)細胞的強烈絲裂原,對血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞均有很強的促絲裂作用。bFGF是近年來發(fā)現(xiàn)的在動脈粥樣硬化和血管損傷過程中介導血管平滑肌增殖的細胞因子。bFGF可誘導血管內(nèi)皮長入膠原基質(zhì)中形成血管腔增加新生血管,從而改善局部缺血。bFGF對防止急性心肌梗死的延展和促進梗死區(qū)側枝循環(huán)重建及心肌梗死后心功能恢復有積極作用。在狗的冠狀動脈內(nèi)注入栓子造成心肌梗死,bFGF冠狀動脈注射治療組能改善心肌功能,搶救心肌缺血,縮小壞死面積。組織學和血管造影等發(fā)現(xiàn)梗死部位有毛細血管和小動脈增加。bFGF緩釋微膠囊治療組實驗兔的心肌梗死面積較對照組明顯減小,且缺血區(qū)微血管計數(shù)明顯增高[6-8]。新近發(fā)現(xiàn)bFGF具有降血壓作用,是由于bFGF可以導致細胞內(nèi)源性舒緩因子合成增加,導致血管舒張[9]。另有研究發(fā)現(xiàn),[9-11]bFGF表達在間質(zhì)纖維化的腎臟標本中明顯升高,而bFGF可強有力誘導成纖維細胞增生。Strutz等在細胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),用TGF-β1孵育6 h后,bFGF mRNA升高3.5倍,認為TGF-β1誘導bFGF合成在TGF-β1介導腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生機制中起重要作用。然而,有關bFGF在MF中的作用,目前未見報道。

本實驗采用多點皮下注射Iso復制大鼠心肌壞死模型。HE染色結果顯示,在注射Iso 12h后即出現(xiàn)點狀壞死,隨時間的延長缺血壞死面積明顯增加,1周達到高峰,出現(xiàn)明顯的纖維化。HE組織形態(tài)學觀察結果提示,注射Iso可成功地引起大鼠心肌缺血性壞死,Masson結果亦顯示,其膠原含量隨Iso注射時間的延長,而逐漸增加(P＜0.01)。為探討bFGF在大鼠缺血性MF中的作用,本文作者應用免疫組織化學及RT-PCR方法,對缺血性心肌壞死所致MF發(fā)生發(fā)展過程中,bFGF蛋白表達水平進行了動態(tài)觀察,結果表明:多點皮下注射Iso引起大鼠心肌缺血性壞死后,bFGF蛋白表達隨時間的延長,蛋白表達逐漸增加(P＜0.01),提示bFGF參與了大鼠心肌壞死后纖維化的發(fā)生及發(fā)展過程。

[1]張 運,徐 瑞.心肌纖維化-心力衰竭治療的新靶標[J].中華醫(yī)藥雜志,2006,86(17):58.

[2]張召才,楊英珍.心肌纖維化的研究進展[J].臨床心血管病雜志,2004,20(1):58.

[3]姜秀春,姜秀麗,李樹青.心肌纖維化發(fā)病機制和防治的研究進展[J].醫(yī)學綜述,2006,12(15):931.

[4]肖厚勤,丁 國,華張建,等.環(huán)氧合酶-2抑制劑對梗阻性腎病大鼠腎組織結締組織生長因子表達的影響[J].家用醫(yī)學雜志,2005,21(3):241.

[5]高海成,于曉艷,李相軍,等.環(huán)氧合酶2在心肌纖維化中的表達及意義[J].吉林大學學報,2008,34(2):233.

[6]Kawai C.From myocarditis to cardiomyopathy:Mechanisms of inflammation and cell death:Learning from the past for the future[J].Circulation,1999,99(2):1091.

[7]Schnee J M,Hsueh W A.AngiotensiⅡ,adhesion,and cardiac fibrosis[J].Cardiaovasc Res,2000,46(2):264.

[8]Kobori H,Lchihara A,Miyashits Y,et al.Local rennin-angiotensin system contributes to hyperthyroidism-induced cardial hypertrophy[J].J Endocrinol,1999,160(1):43.

[9]Hong BK,Kwon HM,ByunKH,et al.Apoptosis in dilated cardiomyopathy[J].Korean J Intern Med,2000,15(1):56.

[10]Li P F,Dietz R,Von Harsdorf R.Superoxide induces apoptosis in cardiomyocytes,but proliferation and expression of transforming growth factorbeta1 in cardiac fibroblasts[J].FEBS Lett,1999,448(2):206.

[11]王健東,潘星華.細胞凋亡調(diào)節(jié)的分子遺傳機制[J].國外醫(yī)學遺傳學分冊,1996.19(2):116.