人參二醇皂苷對大鼠急性重癥胰腺炎多臟器損傷時NF-κ B的影響

任仲喜,王中義,王貴民*,佟偉華,王 蒙,唐小飛,趙雪儉,譚毓銓

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 普外科,吉林 長春130021;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 基本外科,吉林 長春130033;3.吉林大學(xué)第四醫(yī)院;4.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室)

急性重癥胰腺炎(SAP)易并發(fā)多臟器功能損傷,是導(dǎo)致病人死亡的主要原因。研究表明NF-κ B是一種廣泛存在于體內(nèi)多種細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子,參與多種疾病的病理生理過程,在機(jī)體的免疫和炎癥反應(yīng)、凋亡調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。大量研究證實NF-κ B在SAP發(fā)病的早期即被激活,促進(jìn)局部的炎癥病變向全身多系統(tǒng)多臟器發(fā)展[1],在多臟器損傷發(fā)生、發(fā)展過程中均起重要作用。本實驗旨在應(yīng)用大鼠SAP模型,探討人參二醇皂苷(Panaxadiol Saponins,PDS)對SAP多臟器損傷中的保護(hù)機(jī)制。

1.1 材料

200-250 g Wistar大鼠,雄雌不限,購自吉林大學(xué)實驗動物中心;?；悄懰徕c購自 Sigma公司。TNF-α、IL-6放免檢測試劑盒購自解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所。NF-κ B兔抗大鼠多克隆抗體購自Santa Crutz公司;生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗購自Santa Crutz公司。

1.2 動物模型制備和實驗分組

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d-1 w。術(shù)前12 h禁食、不禁水。隨機(jī)分為SAP組、假手術(shù)組(SO)和人參二醇皂苷(PDS)三組,每組8只。①SAP組:乙醚淺麻醉后,上腹部正中切口長約1 cm入腹;找到十二指腸側(cè)壁胰膽管匯合膨大處,用四號針頭(平面朝上)穿刺,成功后向膽總管內(nèi)進(jìn)入約5-6 mm,用無創(chuàng)小血管夾于肝門側(cè)暫時阻閉肝門側(cè)膽管;向膽胰管內(nèi)以0.1 ml/min速度逆行勻速注入5%?；悄懰徕c(劑量為0.1 ml/100 g);10 min后去除動脈夾,關(guān)腹。②SO組:手術(shù)操作方法同SAP組,但不向膽管內(nèi)注入?；悄懰徕c。③人參二醇皂苷(PDS)組,在制模成功后,腹腔內(nèi)注入PDS,劑量為 2.5 mg/100 g。各組動物于手術(shù)結(jié)束后皮下注射0.9%氯化鈉2ml,以補(bǔ)充丟失的水分,于造模6 h后殺鼠。

經(jīng)下腔靜脈采取血液,1 ml血液測定淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗,2 ml行血常規(guī)檢測,5 ml離心(3 000 rpm/min,3 min),取上清。應(yīng)用自動生化分析儀,測定血清中淀粉酶(AMS)、ALT、ALB、BUN 、CREA 以測定肝腎功能等。血清TNF-α、IL-6水平檢測:按照試劑盒使用說明采用放免法測量。

取部分肝、腎、小腸以10%甲醛固定后行NF-κ B免疫組化及組織學(xué)觀察。應(yīng)用SABC免疫組織化學(xué)染色法。一抗:兔抗鼠NF-κ B多克隆抗體(1∶500稀釋濃縮型抗體);二抗:生物素標(biāo)記的兔抗鼠IgG,顯微鏡下觀察組織中NF-κ B表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計方法

各組數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間差別應(yīng)用專業(yè)統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS10.0進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié)果

結(jié)果見表1-2,圖1-9。

表1 血液常規(guī)檢查以及炎癥介質(zhì)的改變(n=48,s)

表1 血液常規(guī)檢查以及炎癥介質(zhì)的改變(n=48,s)

與SO比較*P＜0.01,**P＜0.05;與SAP比較#P＜0.01,##:P＜0.05

組別 WBC(×109/L)RBC(×1012/L)Hb(g/L)HCT 淋轉(zhuǎn)率 TNFα(pg/ml)IL-6(pg/ml)SO 10.80±2.86 7.12±0.53 145.20±9.63 0.46±0.03 1.40±0.05 0.48±0.06 24.25±12.39 SAP 11.52±5.04 8.94±1.55** 175.17±26.02** 0.58±0.07** 1.33±0.05** 0.91±0.19* 76.06±27.01*PDS 8.46±1.59 7.11±0.89## 143.4±3.44## 0.46±0.04## 1.32±0.06 0.606±0.098# 30.99±12.46#

表2 不同實驗組肝腎功能的改變

圖1 SO組NF-kB于腎小管細(xì)胞有一定(胞漿中)表達(dá)

圖2 SAP組NF-kB于腎小管細(xì)胞高表達(dá),出現(xiàn)核內(nèi)遷移

圖3 PDS組NF-kB 表達(dá)減少

圖4 SO組NF-kB于肝細(xì)胞有一定(胞漿中)表達(dá)

圖5 SAP組NF-kB于肝細(xì)胞高 表達(dá),出現(xiàn)核內(nèi)遷移

圖6 PDS組NF-kB表達(dá)減少

圖7 S O組NF-kB于小腸粘膜細(xì)胞有一定(胞漿中)表達(dá)

圖8 SAP組NF-kB于小腸細(xì)胞高表達(dá),出 現(xiàn)核內(nèi)遷移

圖9 PDS組小腸絨毛上NF-kB有一定表達(dá)

3 討論

急性重癥胰腺炎是危及人們生命的重要疾病,死亡率較高,多與MODS發(fā)生有關(guān)。SAP時肝臟不僅是一個受損臟器,急性胰腺炎患者肝功能異常率高[2]。而且由于其特殊復(fù)雜的生理功能又使之成為對AP病情進(jìn)展影響最大的臟器,它可能對急性胰腺炎時胰外臟器的損害有介導(dǎo)作用,其實質(zhì)為程度不等的MODS。防治MODS是治療SAP方案中的重要組成部分,是降低其死亡率和縮短其病程的關(guān)鍵所在。

TNF、IL-6等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生與活化與NF-κ B活化有關(guān)。石力[3]等應(yīng)用胰膽管逆行注入?；悄懰徕c制作的急性胰腺炎時發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎組及應(yīng)用NF-κ B活性抑制劑吡咯基二硫氨基甲酸酯處理后,NF-κ B活性、TNF-αmRNA 表達(dá)以及血漿ALT水平均顯著低于AP組。說明急性胰腺炎發(fā)生時,肝臟中活化的NF-κ B促進(jìn)了TNF-αmRNA 的表達(dá),并參與了肝損傷的發(fā)生。

急性胰腺炎患者早期外周血中核因子-κ B明顯激活[4],急性胰腺炎發(fā)生時,胰腺組織中NF-κ B高度活化,促進(jìn)了TNF-α mRNA的表達(dá),從而加重了胰腺的損傷[5]。急性壞死性胰腺炎時伴有肺損傷發(fā)生,且肺組織內(nèi)NF-κ B活化及iNOS mRNA表達(dá)明顯上調(diào),NF-κ B的活化與iNOS mRNA表達(dá)上調(diào)相關(guān),其上調(diào)水平與胰腺、肺組織的損傷程度也有一定關(guān)系。應(yīng)用N-乙酰半胱氨酸(NAC)可能通過抑制肺NF-κ B活性及iNOS mRNA的表達(dá),減輕肺損害[6]。應(yīng)用圈套技術(shù)抑制NF-κ B的活性及減少下游炎癥介質(zhì)的表達(dá),可減輕SAP并發(fā)的肺組織損傷[7]。我們通過實驗發(fā)現(xiàn)SAP時多臟器如肝腎小腸等臟器NF-κ B表達(dá)增加,血清炎癥介質(zhì)表達(dá)增加,促進(jìn)了臟器損害的發(fā)生。袁耀宗[8]等研究發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎時存在肝、肺損傷,肺組織NF-κ B活化并通過促進(jìn)TNF-α、IL-6、細(xì)胞間粘附分子1 mRNA的表達(dá)參與肺損傷;肝組織NF-κ B活化并通過促進(jìn)TNF-α、IL-6的表達(dá)參與肝損傷。血清TNF-α升高并可能通過上調(diào)胰腺組織中TNF受體mRNA表達(dá)參與加重胰腺組織損傷;同時也促進(jìn)外周血單核細(xì)胞中TNFR mRNA的表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致外周血中白細(xì)胞的活化,從而加重胰腺組織損傷。NF-κ B調(diào)控 100多種基因,包括細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β 、IL-6 等 ;粘附分子 、趨化因子、一氧化氮合酶等[9,10]。上述基因相互作用,構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),使其炎癥范圍擴(kuò)大。因此,NF-κ B是急性胰腺炎發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,它“信使”樣的介導(dǎo)作用將局部的胰腺病變和全身多器官功能衰竭聯(lián)系起來。

人們試圖通過減少NF-κ B表達(dá)以減輕臟器功能的損害。如應(yīng)用應(yīng)用NF-κ B活性抑制劑吡咯基二硫氨基甲酸酯[2]、N-乙酰半胱氨酸[5]。PDS是從人參中提取的天然活性成分,它毒性低、分子量小,可通過提高SOD活力,清除氧自由基,保護(hù)生物膜,因此對梗阻性黃疸肝損傷有保護(hù)作用[11]。我們實驗中發(fā)現(xiàn),造模成功后胰腺組織壞死,大量腹水,血液濃縮,血清中炎癥介質(zhì)大量釋放,淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率增加,組織中NF-κ B表達(dá)增加并且出現(xiàn)核內(nèi)遷移,導(dǎo)致肝腎等臟器功能損害。造模后注射人參二醇皂苷,降低了肝、腎、小腸等組織中NF-κ B表達(dá)、抑制其活化核遷移,有效降低血清中炎癥介質(zhì)TNF、IL-6的表達(dá),紅細(xì)胞容積下降有效改善SAP后血液濃縮狀況,淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率下降,減輕多臟器功能受損情況的發(fā)生。PDS在許多方面具有與地塞米松相似的生理作用,可以通過抑制LPS介導(dǎo)的CD14-NF-κ B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的過度激活實現(xiàn)對臟器保護(hù)[12]。PDS還具有降血脂、抗血小板聚集、提高機(jī)體免疫力、預(yù)防感染等作用,是DEX等合成藥無法比擬的,在許多方面有望替代地塞米松的作用,具有樂觀的應(yīng)用前景。

[1]Chen X,Ji B,Han B,et al.NF Kappa B activation in pancreas induces pancreatic and systemic inflammatory response[J].Gastroenterology,2002,122:448.

[2]于 君,湯紹迂,吳晶新.急性胰腺炎合并肝臟損害(附91例臨床分析)[J].中華消化雜志,1996,16(4):240.

[3]石 力,田伏洲,李 旭,等.急性胰腺炎大鼠肝臟NF-κ B對TNF-α表達(dá)的調(diào)控及其在肝損傷中的作用[J].中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2004,11(3):228.

[4]師 陽,李 彬,常 樂.核因子-κ B激活在急性重癥胰腺炎發(fā)病中的作用[J].實用診斷與治療雜志,2008,22(5):348.

[5]薛東波,王海洋,張偉輝.核因子-κ B對急性胰腺炎時腫瘤壞死因子α mRNA表達(dá)的調(diào)控[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志,2006,15(2):103.

[6]朱 斌,孫家邦,張淑文,等.NF-κ B活化及iNOS基因表達(dá)在急腺炎肺損傷中的作用胰腺炎肺損傷中的作用[J].中華肝膽外科雜志,2004,10(4):248.

[7]張 泓,李 磊,毛恩強(qiáng).NF-κ B圈套技術(shù)在小鼠重癥急性胰腺炎并發(fā)肺損傷中的實驗研究[J].中華肝膽外科雜志,2009,15(1):49.

[8]袁耀宗,紀(jì) 龍.核因子-κ B在重癥急性胰腺炎肝損傷中的作用研究[J].上海醫(yī)學(xué),2002,25(3):172.

[9]Schmid RM,Adler G.NF-κ appaB/rel/Iκ appaB:imp lications ingastrointestinal diseases[J].Gastroenterology,2000,118(6):1208.

[10]Jiang B,Xu S,Hou X,et al.Temporal control of NFκ appaB,activation by ERK differentially regulates interleukin21 beta2induced gene expression[J].J Biol Chem,2004,279(2):1323.

[11]張學(xué)武,陳麗艷,崔長旭.人參二醇組皂苷對梗阻性黃疸大鼠肝損傷保護(hù)作用機(jī)理的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2006,17(5):771.

[12]李 璐,劉喜春,于振香.人參二醇皂苷對內(nèi)毒素休克大鼠肺CD14和NF-κ B表達(dá)的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2005,31(2):231.