離子液體[BMIM]Cl對土壤理化性質(zhì)及其微生物的影響

童彥杰，王啟軍，馬亞麗，呂椰子，劉洋洋，張 瑞，吳元欣，朱圣東*

(1. 武漢工程大學化工與制藥學院，綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室，湖北省新型反應器和綠色工藝重點實驗室，湖北 武漢 430074；2.西南大學園藝園林學院，南方山地園藝學教育部重點實驗室，重慶 400715)

0 引 言

盡管離子液體不會揮發(fā)進入環(huán)境而造成大氣污染，但在離子液體大規(guī)模工業(yè)化使用過程中，仍有可能在事故狀態(tài)或是通過泄露而進入環(huán)境造成水體或是土壤污染[7].因此，離子液體的的毒性數(shù)據(jù)，作為離子液體工業(yè)應用的基礎數(shù)據(jù)的一個重要組成部分，有必要進行深入系統(tǒng)的研究[8].對離子液體的毒性人們已經(jīng)進行了一些初步的研究工作，包括在分子和細胞層面的毒性研究及對微生物、植物和動物在個體和種群層面的毒性研究，并已經(jīng)總結出了一些離子液體結構與毒性之間的關系規(guī)律[9-12].然而根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的文獻來看，在離子液體的毒性研究方面，毒性實驗對象僅限于分子和細胞層面以及個體和種群層面，未見毒性實驗對象在生物群落和生態(tài)層面上的毒性研究報道.而離子液體毒性研究的目的在于了解離子液體對生物群落以及生態(tài)環(huán)境的影響.因此本實驗以研究最為深入的離子液體1-丁基-3-甲基咪唑氯化鹽(1-butyl-3-methylimidazolium chloride，[BMIM]Cl)為研究對象，對荒地和苗圃兩種土壤的理化性質(zhì)以及土壤微生物群落影響進行研究.由于放線菌與人類生活生產(chǎn)有著密切關系，以及其在污水處理方面的應用，并且在土壤中有著主要的分布，因此本實驗選取放線菌和細菌作為微生物群落的研究對象.

1 實驗部分

1.1 主要材料

1.1.1 實驗土樣 荒地土壤樣品取自于武漢市郊區(qū)的廢棄農(nóng)業(yè)用地，苗圃土壤樣品取自于武漢工程大學園林花卉中心.每個采樣區(qū)隨機選取10個以上的取土點，去掉地表層土壤，采集1～15 cm深度范圍的土壤，然后將不同點的土壤充分混合.室溫風干，過篩，顆粒小于2 mm，裝入塑料袋，4 ℃儲藏，備用.

荒地土壤樣品和苗圃土壤樣品都分成8分，1份作為對照組，不加入[BMIM]Cl，其余7份分別加入不同質(zhì)量濃度的[BMIM]Cl，使實驗樣品中[BMIM]Cl的質(zhì)量濃度分別為10 g·kg-1、1 g·kg-1、0.1 g·kg-1、0.01 g·kg-1、0.001 g·kg-1、0.000 1 g·kg-1和0.000 01 g·kg-1.在恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫放置兩周后，再用于理化性質(zhì)和微生物數(shù)量的測定測定.

1.1.2 實驗試劑 實驗用離子液體[BMIM]Cl購自河南利華制藥公司.其它實驗化學藥品均購自于國藥集團化學試劑有限公司，生物培養(yǎng)基購自于北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠.

1.2 實驗方法

1.2.1 理化性質(zhì)的測定a．pH值的測定.稱取過篩的土壤樣品10.0 g，置于裝有25.0 mL去離子水的玻璃瓶中，攪拌均勻，靜止30 min，以BeckmanΦ690酸度計測量[13].

b．土壤可溶性鹽含量的測定.稱取經(jīng)過篩(篩孔1 mm2)的風干土粉40 g，加入經(jīng)煮沸冷卻后的蒸餾水200 mL，振蕩3 min后過濾，取濾液50 mL，放在經(jīng)烘干稱出一定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后滴加2～3 mL質(zhì)量分數(shù)10%～15%的雙氧水以氧化除去有機雜質(zhì)，再蒸干，再加雙氧水，再蒸干，反復數(shù)次至殘渣呈白色或略帶黃色為止，在105 ℃～110 ℃的恒溫烘箱中烘至恒重，稱出蒸發(fā)皿加殘渣的總質(zhì)量[13].

c．土壤有機質(zhì)含量測定. 土壤有機質(zhì)含量采用沖鉻酸鉀滴定法，具體方法參照GB 9834-88.

1.2.2 生物量的測定a．土壤中微生物活菌計數(shù). 采用微生物活菌計數(shù)法測定土樣中的微生物[14].稱取土樣10.0 g，裝入90 mL無菌水中，振蕩30 min，取1.0 mL土壤懸液于裝有9.0 mL無菌水的試管中，充分混勻，再取1.0 mL土壤懸液于裝有9.0 mL無菌水的試管中，充分混勻，依次稀釋6次.然后吸取不同稀釋度的菌懸液各0.1 mL至培養(yǎng)基已凝固的培養(yǎng)皿中，用刮產(chǎn)涂布均勻.細菌計數(shù)用牛肉膏蛋白胨-制霉菌素培養(yǎng)基；放線菌計數(shù)用高氏一號培養(yǎng)基.28 ℃倒置培養(yǎng)細菌2 d、放線菌3 d后統(tǒng)計各培養(yǎng)皿的菌落數(shù)(colony forming units，CFU).計算土壤中微生物的數(shù)量.每個土樣做3次重復.

b．半有效濃度EC50測定. 半有效濃度是毒理研究中的一個重要指標，表示毒物對微生物生長的抑制作用強弱程度，定義為微生物數(shù)量為對照組50%時所對應的毒物濃度.本實驗采用平板計數(shù)法來確定離子液體[BMIM]Cl對土壤微生物(包括細菌和放線菌)的半有效濃度[15].

2 結果與討論

2.1 不同含量的離子液體[BMIM]Cl對土壤理化性質(zhì)的影響

2.1.1 不同含量的離子液體[BMIM]Cl對土壤可溶性鹽含量的影響 離子液體[BMIM]Cl對土壤的可溶性鹽含量的影響如圖1所示.隨著離子液體[BMIM]Cl的含量的增大，可溶性鹽含量明顯呈上升趨勢.由于離子液體[BMIM]Cl本身在水中有較高的溶解度，所以作為一種可溶性鹽，在土壤中，離子液體[BMIM]Cl仍舊以離子態(tài)存在，而且因為其存在，還可能影響土壤的滲透壓從而對土壤的生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生影響.另外，從圖1可知，荒地土壤樣品的可溶性鹽含量比苗圃土壤樣品略高，對照組中，荒地土壤樣品的可溶性鹽含量為(0.77±0.037) g·kg-1，而苗圃土壤樣品的可溶性鹽含量為(0.68±0.033) g·kg-1.但總的來說，雖然荒地和苗圃兩個土樣的樣地點和肥沃程度都不同，但是其可溶性鹽含量相當接近，這說明土壤中的可溶性鹽含量相對固定，相對于離子液體[BMIM]Cl來說，受土壤微生物，植物和人類活動影響較小.

圖1 不同含量離子液體[BMIM]Cl對土壤可溶性鹽含量的影響

2.1.2 不同含量離子液體[BMIM]Cl對土壤pH值的影響 離子液體[BMIM]Cl對荒地和苗圃土壤樣品pH的影響見圖2.從圖2可知，雖然荒地土壤的對照組pH值(6.76±0.03)比苗圃土壤對照組(6.47±0.03)要高，但是隨著離子液體[BMIM]Cl含量的增加，土壤pH值的變化逐漸明顯.而且，不難發(fā)現(xiàn)，在較低質(zhì)量濃度的離子液體[BMIM]Cl存在的情況下，苗圃土壤樣品對離子液體[BMIM]Cl的敏感度要比荒地樣品高.這種現(xiàn)象的原因是因為土壤本身對酸堿有一定的調(diào)節(jié)作用，一旦離子液體[BMIM]Cl的含量過大，超出土壤自身的調(diào)節(jié)范圍，就會導致土壤pH值的急劇降低.由此可見離子液體[BMIM]Cl作為一種強酸弱堿鹽，在一定質(zhì)量濃度下能夠?qū)е峦寥纏H值相應的變化.

圖2 不同含量的離子液體[BMIM]Cl對土壤pH值的影響

2.1.3 不同含量離子液體[BMIM]Cl對土壤有機質(zhì)含量的影響 離子液體[BMIM]Cl對荒地土壤和苗圃土壤的影響如圖3所示，隨著離子液體[BMIM]Cl含量的增加，土壤中有機質(zhì)含量也呈上升趨勢；并且變化趨勢與可溶性鹽含量和pH值的變化趨勢相似，土壤中有機質(zhì)含量在低濃度的離子液體[BMIM]Cl土壤樣品中變化較小，在高濃度的離子液體[BMIM]Cl土壤樣品中變化較大.由于兩種土壤樣品的肥沃程度不同，有機質(zhì)含量也有很大的不同.在荒地土壤樣品中，對照組的有機質(zhì)含量為(8.38±0.35) g·kg-1；苗圃土壤樣品中對照組的有機質(zhì)為(12.41±0.49) g·kg-1，是荒地的1.48倍.因此，離子液體[BMIM]Cl作為一種陽離子為有機物質(zhì)的可溶性鹽，在其加入到土壤后，土壤的有機質(zhì)總含量受到一定影響.

2.2 不同含量的離子液體[BMIM]Cl對土壤微生物群落的影響

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中一個重要的成分，對土壤中生命物質(zhì)的新陳代謝起著關鍵的作用.因此對土壤微生物的分析，是對離子液體生態(tài)毒性分析的一個重要的指標.

圖3 不同含量的離子液體[BMIM]Cl對土壤有機質(zhì)含量的影響

表1給出了兩種不同土壤樣品中細菌和放線菌在不同濃度離子液體[BMIM]Cl作用下微生物數(shù)量的變化數(shù)據(jù).從表1中可知，由于兩種土壤樣品的取樣地點和其相應的人類活動不同，其細菌和放線菌數(shù)量有著非常顯著的差異.放線菌的數(shù)量在在荒地土壤樣品的對照組(11.6±0.83×106)和苗圃土壤樣品的對照組(8.60±0.81×105)中整整相差一個數(shù)量級；而細菌在苗圃土壤樣品中對照組的數(shù)量是在荒地中對照組數(shù)量的2倍.因此，由于所選樣品的顯著差異，其微生物含量也有著明顯的差異.

無論是在荒地土壤樣品還是在苗圃土壤樣品中，隨著離子液體[BMIM]Cl含量的增加，無論是放線菌還是細菌的數(shù)量都在相應的減少.從而明顯的體現(xiàn)出離子液體[BMIM]Cl加入后，對微生物群落生長和代謝的抑制作用.

圖4給出了離子液體[BMIM]Cl對荒地土壤和苗圃土壤的細菌和放線菌的半有效濃度.從圖4可以看出，無論在荒地土壤樣品中細菌還是放線菌的的半有效濃度都小于苗圃土壤樣品.而就同種土壤中的細菌和放線菌的半有效濃度而言，荒地土壤樣品中細菌的半有效質(zhì)量濃度為0.032 5 g·kg-1，小于放線菌的半有效質(zhì)量濃度0.043 8 g·kg-1；而苗圃土壤樣品中細菌的半有效質(zhì)量濃度為0.486 g·kg-1，大于放線菌的半有效質(zhì)量濃度0.447 g·kg-1.由此可知微生物的半有效質(zhì)量濃度跟其在土壤中的含量有著密切的關系，生物的群落越大，其半有效濃度也相應的越大.

表1 不同含量離子液體[BMIM]Cl對土壤微生物數(shù)量的影響

圖4 離子液體[BMIM]Cl對土壤微生物群落的半有效濃度

3 結 語

通過離子液體[BMIM]Cl對兩種不同土壤的理化性質(zhì)和微生物群落影響的實驗和分析，得出如下結論：

a.離子液體[BMIM]Cl對土壤理化性質(zhì)影響的研究表明，土壤中的有機質(zhì)含量和可溶性鹽含量隨著離子液體[BMIM]Cl濃度的增加而增加，但是pH值隨著離子液體[BMIM]Cl濃度的增加而降低.

b. 離子液體[BMIM]Cl對土壤微生物群落影響的研究表明，隨著離子液體[BMIM]Cl濃度的逐漸增大對土壤的微生物群落有著明顯的抑制作用.通過對荒地和苗圃兩種土壤樣品中細菌微生物群落和放線菌微生物群落的離子液體[BMIM]Cl半有效濃度的的測定，對離子液體[BMIM]Cl的生態(tài)毒性數(shù)據(jù)進行補充和量化，而且也證明了離子液體[BMIM]Cl對土壤生物群落的毒性.

4 致 謝

本工作得到湖北省新型反應器與綠色工藝重點實驗室開放基金(RGCT201005)的資助，實驗過程中得到華中農(nóng)業(yè)大學鄭世學博士的指導與幫助，對此表示感謝！

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