Plant MetGen MAP數(shù)據(jù)庫(kù)分析水稻表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)的方法初探

劉 峙, 劉 莉, 付月靈, 張文蔚, 簡(jiǎn)桂良, 齊放軍

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展和功能基因組學(xué)的興起,許多DNA內(nèi)在的信息需要我們?nèi)プ⑨?。這就需要處理大量的信息,包括大規(guī)模的DNA序列解析、比對(duì)以及基因功能的鑒別等[1]?；蛐酒夹g(shù)正是滿足了這種需求,才得以快速發(fā)展。Fodor等首先提出了DNA芯片的概念[2]。經(jīng)過(guò)十多年的發(fā)展,該技術(shù)已逐漸發(fā)展成熟并獲得廣泛應(yīng)用。近年來(lái),基因芯片已應(yīng)用于水稻基因表達(dá)譜的分析[3-5]。科學(xué)地解讀基因芯片數(shù)據(jù),才能將數(shù)據(jù)結(jié)果與生命活動(dòng)聯(lián)系起來(lái),進(jìn)而闡明基因表達(dá)與生命活動(dòng)的規(guī)律。

Plant MetGenMAP是美國(guó)康奈爾大學(xué)Boyce ThoMpson植物研究所開發(fā)的一個(gè)在線分析系統(tǒng),可以分析大量的基因表達(dá)數(shù)據(jù),并揭示基因表達(dá)量、代謝途徑及生命活動(dòng)的變化情況[6]。本研究以A ffymetrix的表達(dá)譜芯片的數(shù)據(jù)為例,利用 Plant MetGenMAP數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)水稻受病原菌侵染后基因表達(dá)量及代謝途徑的變化進(jìn)行了初步的分析,為分析基因芯片數(shù)據(jù)提供了一種新方法。

1 材料與方法

1.1 水稻的培養(yǎng)

選擇飽滿一致的水稻(Oryzae sativa Linn.cv.Nipponbare)種子,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%H2O2消毒30 min,蒸餾水沖洗數(shù)次,放入26℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽3 d。選擇發(fā)芽一致的種子播于盛有營(yíng)養(yǎng)土的塑料盆中,放入光照培養(yǎng)箱,在28℃/16 h光照,24℃/8 h黑暗,濕度為75%的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)至三葉期接種。

1.2 菌株的培養(yǎng)

挑取水稻白葉枯病菌JxoI(Xanthomonas oryzae pv.oryzae;JxoI)、非寄主病原菌Xv5(X.caMpestrispv.vesicatoria;Xv5)的單菌落,分別培養(yǎng)于4 ML LB液體培養(yǎng)基中,28℃,200 r/min,培養(yǎng)48 h,取1ML培養(yǎng)液加入到50ML LB液體培養(yǎng)基中,28℃,200 r/min,培養(yǎng)6 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.3 噴霧接種和樣品采集

培養(yǎng)好的菌液濃度調(diào)至108cfu/ML,噴霧接種水稻,以噴清水作對(duì)照。接種后的水稻置于飽和濕度、30℃、暗光條件下培養(yǎng)。

接菌24 h后取樣。采集接菌后的水稻葉片,迅速用液氮凍存,-80℃保存。

1.4 總RNA提取

水稻葉片總 RNA提取采用熱酚法[7],乙醇洗滌、干燥,得到 RNA樣品。

1.5 芯片測(cè)試

各處理的RNA樣品委托博奧生物芯片公司,用A ffyMetrix水稻全基因組芯片,進(jìn)行表達(dá)譜的測(cè)試。

1.6 Plant MetGenMAP數(shù)據(jù)庫(kù)分析

所采用的水稻A ffymetrix芯片檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)如表1所列。本研究以3組A ffymetrix表達(dá)譜檢測(cè)結(jié)果Jxo I vs清水、Xv5 vs清水及Jxo I vs Xv5為對(duì)象,分析A ffymetrix表達(dá)譜芯片的數(shù)據(jù)。Jxo I vs清水表示噴清水的水稻為對(duì)照材料,接種Jxo I的水稻為試驗(yàn)材料,進(jìn)行兩兩比較,從而得到基因表達(dá)量的變化倍數(shù)。Xv5 vs清水、Jxo I vs Xv5代表含義與此類同。登錄 Plant MetGenMAP(http：∥bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/MetGenMAP/home.cgi),將3組(Jxo I vs清水、Xv5 vs清水及Jxo I vs Xv5)試驗(yàn)數(shù)據(jù)上傳至Plant MetGenMAP數(shù)據(jù)庫(kù)。該試驗(yàn)數(shù)據(jù)的格式為文本文檔格式,內(nèi)容包括探針編號(hào)(如OS.53924.1.S1_at)及該基因表達(dá)量的變化倍數(shù)(fold change)。利用該數(shù)據(jù)庫(kù)分析各組數(shù)據(jù)的測(cè)試結(jié)果。

表1 Affymetrix芯片檢測(cè)結(jié)果

2 數(shù)據(jù)分析結(jié)果

2.1 基因表達(dá)量的變化情況

在3組試驗(yàn)中,基因表達(dá)量的變化情況見(jiàn)表2。以表達(dá)量上調(diào)2倍及以上(fold change≥2)的基因?yàn)楸磉_(dá)量顯著上調(diào)的基因,表達(dá)量下調(diào)2倍及以上(fo ld change≤-2)的基因?yàn)楸磉_(dá)量顯著下調(diào)的基因。

表2 基因表達(dá)量的變化

2.2 PlantMetGenMAP數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果

2.2.1 代謝途徑的變化情況

利用Plant MetGenMAP中“changed pathway”分析功能,可以分析3組試驗(yàn)中水稻代謝途徑的變化情況。從表3中可以發(fā)現(xiàn),水稻受白葉枯病菌Jxo I及非寄主菌Xv5侵染后,代謝途徑的變化存在顯著差異。白葉枯病菌JxoI引起的表達(dá)量下調(diào)的代謝途徑數(shù)量多于上調(diào)的數(shù)量,而非寄主菌Xv5引起的表達(dá)量上調(diào)的代謝途徑數(shù)量遠(yuǎn)多于下調(diào)的數(shù)量。這大致反映了白葉枯病菌JxoI與水稻發(fā)生親和性互作,與防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)的代謝途徑主要受到抑制,而非寄主菌Xv5與水稻發(fā)生非親和性互作,與防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)的代謝途徑主要被激活的狀況。

表3 代謝途徑變化情況

利用Plant MetGenMAP數(shù)據(jù)庫(kù),還可以分析某一代謝途徑中各個(gè)基因表達(dá)量的變化情況。以水楊酸合成途徑為例,在JxoI vs清水中,水楊酸合成途徑上調(diào)表達(dá),其中1個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)2倍以上,5個(gè)基因表達(dá)量在0～2倍之間;在Xv5 vs清水中,水楊酸合成途徑也上調(diào)表達(dá),其中1個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)2倍以上,2個(gè)基因表達(dá)量在0～2倍之間。具體的變化情況見(jiàn)圖1,圖中黑色圖框表示該基因表達(dá)上調(diào)2倍以上,灰色圖框表示該基因表達(dá)量在0～2倍之間。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn),OS.10930.1.S1_at探針標(biāo)記的基因(LOC_Os02g41670)在兩組試驗(yàn)中表達(dá)量均上調(diào)2倍以上(在JxoI vs清水中上調(diào)2.52倍,在Xv5 vs清水中上調(diào)3.01倍)。由PlantMetGenMAP注釋信息得知,該基因(LOC_Os02g41670)編碼苯丙氨酸解氨酶,參與苯基丙酸類合成途徑起始階段(phenylpropanoid biosynthesis,initial reactions)、水楊酸合成途徑(salicylate biosynthesis)及軟木脂合成途徑(suberin biosynthesis),在應(yīng)答外界脅迫及刺激等生命活動(dòng)中發(fā)揮作用。這一分析結(jié)果與苯丙氨酸解氨酶在植物抗病過(guò)程中發(fā)揮的作用完全一致。在植物防衛(wèi)反應(yīng)次生代謝途徑中,苯丙烷類代謝途徑起著十分重要的作用,可形成一些次生抗病物質(zhì),如植保素、木質(zhì)素等,而苯丙氨酸解氨酶是這一途徑的關(guān)鍵酶和限速酶[8-15]。這一結(jié)果說(shuō)明利用PlantMetGenMAP數(shù)據(jù)庫(kù)可以準(zhǔn)確地分析水稻抗病代謝途徑的變化情況及關(guān)鍵的調(diào)控基因。

圖1 水楊酸合成途徑各基因表達(dá)變化情況示意圖

2.2.2 Gene Ontology分析

利用PlantMetGenMAP數(shù)據(jù)庫(kù)中GeneOntology(GO)分析功能,以JxoI vs清水為例,進(jìn)行聚類分析,檢查基因的富集情況,分類依據(jù)為差異基因構(gòu)成的細(xì)胞組分(cellu lar components)及參與的生物學(xué)過(guò)程(biological process)。在JxoI vs清水中,差異基因的富集情況見(jiàn)圖2?；蚋患治鼋沂玖瞬町惢蛟诟鱾€(gè)細(xì)胞組成中的表達(dá)情況及參與的生物學(xué)過(guò)程。通過(guò)GO分析差異基因的富集情況,有助于更好地了解水稻受病原菌侵染后,基因表達(dá)的變化規(guī)律。例如,在本例中,通過(guò)GO進(jìn)行聚類分析,發(fā)現(xiàn)水稻受白葉枯病原菌JxoI侵染后,差異表達(dá)的基因多是參與新陳代謝過(guò)程(metabolic process)、細(xì)胞過(guò)程(cellular process)、應(yīng)答刺激(response to stimulus和 abiotic stimulus)等。這為我們進(jìn)一步研究水稻與病原菌互作的分子機(jī)制、探尋水稻抗/感病分子機(jī)理、發(fā)掘新的抗病基因奠定了基礎(chǔ)。

3 討論

基因芯片技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用在水稻基因組的研究中。相對(duì)于幾種傳統(tǒng)的用于檢測(cè)基因表達(dá)水平的方法,如 RT-PCR、Northern雜交、MRNA 差別顯示等,高通量檢測(cè)是基因表達(dá)譜芯片的優(yōu)勢(shì)?；虮磉_(dá)譜芯片可以平行檢測(cè)眾多基因的表達(dá)情況,有助于全面了解植物在特殊處理、環(huán)境因子影響、發(fā)育階段、病原菌侵染等條件下較為完整的基因表達(dá)情況。通過(guò)與樣本對(duì)照,分析與特定事件相關(guān)的基因,進(jìn)而確定相應(yīng)基因的功能或多個(gè)基因間的協(xié)同作用[5]。而對(duì)于基因表達(dá)譜芯片的解讀是這些研究的關(guān)鍵所在。

圖2 JxoI vs清水差異基因富集圖

基因芯片數(shù)據(jù)分析是解讀基因芯片數(shù)據(jù)的關(guān)鍵。目前,可以分析基因表達(dá)量變化情況、代謝途徑變化情況,并且進(jìn)行GO(Gene Ontology)分析的數(shù)據(jù)庫(kù)有很多,如博奧生物公司采用的MAS(molecule annotation system)系統(tǒng),GenMAPP分析軟件等。但這些分析工具有著明顯的不足之處,如MAS系統(tǒng)目前只能提供代謝途徑的網(wǎng)狀圖,而無(wú)法顯示代謝途徑中基因表達(dá)量的變化情況;GenMAPP目前提供的數(shù)據(jù)庫(kù)多是哺乳動(dòng)物的數(shù)據(jù)庫(kù),明顯缺少植物物種,適用于哺乳動(dòng)物的研究。而Plant MetGenMAP數(shù)據(jù)庫(kù)適用于擬南芥、水稻、番茄基因芯片的分析,并且可以將基因表達(dá)量的變化情況與代謝途徑的改變情況結(jié)合在一起進(jìn)行分析,結(jié)果簡(jiǎn)潔直觀,為進(jìn)一步研究基因功能和代謝途徑提供了方便。

本文利用A ffymetrix全基因組芯片測(cè)試結(jié)果,通過(guò)Plant MetGenMAP數(shù)據(jù)庫(kù),初步分析了水稻受白葉枯病菌JxoI、非寄主菌Xv5侵染后基因表達(dá)的變化以及代謝途徑的改變情況,分析結(jié)果直觀、清晰明了,這為進(jìn)一步發(fā)掘水稻抗病基因、研究水稻抗病防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)通路、揭示水稻抗/感病分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。同時(shí),提供了一種利用Plant MetGen-MAP數(shù)據(jù)庫(kù)分析基因芯片數(shù)據(jù)的方法。

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