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    光皮樹的組織培養(yǎng)研究初探

    2011-06-11 02:12:12彭曉英劉永濤周雙德趙黎明張良波
    湖南林業(yè)科技 2011年6期
    關(guān)鍵詞:光皮腋芽莖段

    劉 清,彭曉英*,劉永濤,周雙德,趙黎明,張良波

    (1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410128; 2.湖南省林業(yè)科學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410004)

    光皮樹 (Swida wilsoniana Wanaer)為山茱萸科(Cornaceae)梾木屬 (Swide opiz)落葉灌木或喬木,其干果含油率達(dá)26%~36%,且果實(shí)油中含油酸和亞油酸高達(dá)77.68%,可通過酯化工藝制取生物柴油[1-2]。其燃料特性和動(dòng)力性與0#柴油相似,是一種優(yōu)良的代用燃料[3-5]。對(duì)石油能源枯竭的擔(dān)憂,以及利用光皮樹油制取生物柴油研究的快速開展,使得光皮樹作為重要的生物柴油原料得到廣泛關(guān)注。

    目前,光皮樹的繁殖主要是通過播種育苗、扦插育苗和嫁接繁殖[6-8],播種育苗子代個(gè)體分化明顯,難以保持母本的優(yōu)良性狀;而扦插和嫁接育苗周期較長(zhǎng),易受病蟲害影響。如能運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)建立光皮樹無性系,則可以不受氣候影響,在較短時(shí)間內(nèi)繁育大量光皮樹良種苗木[7]。因此,本研究擬采用組織培養(yǎng)手段,通過愈傷組織的誘導(dǎo)和分化及腋芽增殖等途徑,旨在建立光皮樹離體繁殖體系。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    采自湖南省林業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)林苗圃的光皮樹成熟種子 (2007年11月成熟)和嫩枝條 (2008年3月采集)。

    1.2 方法

    1.2.1 光皮樹種子和嫩枝條處理

    (1)光皮樹種子處理:將光皮樹種子摩擦破皮,消毒后接種于基本培養(yǎng)基中。15 d左右種子開始萌動(dòng),長(zhǎng)出子葉和胚軸。分別以子葉和胚軸為外植體進(jìn)行培養(yǎng)。

    (2)光皮樹嫩枝條處理:將采集的嫩枝條放在裝有少許自來水的燒杯中,培育一周左右。待光皮樹腋芽伸長(zhǎng)后,分別以莖段、頂芽、葉片和帶腋芽的莖段為外植體進(jìn)行培養(yǎng)。

    1.2.2 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)室溫度25±2℃,日光燈光照14 h/d,光照強(qiáng)度為2 000 lx。

    1.2.3 取材與接種 將光皮樹種子接種到基本培養(yǎng)基上,獲得無菌種子苗。①切割其胚軸和子葉分別以平放和豎插兩種方式轉(zhuǎn)入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。②切割莖段、頂芽、葉片和帶腋芽莖段為外植體,莖段和頂芽切段、葉片切塊,用70%酒精快速浸泡,無菌水沖洗后轉(zhuǎn)入0.1%的升汞中消毒,無菌水沖洗3次。70%酒精的浸泡時(shí)間取0、30、60 s,0.1%升汞溶液的消毒時(shí)間取4、6、9 min。然后接種于基本培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。10 d后統(tǒng)計(jì)污染率,20 d后統(tǒng)計(jì)褐化率。

    1.2.4 愈傷組織誘導(dǎo) 將切割的莖段、頂芽、葉片、胚軸、子葉和帶腋芽的莖段分別接種于附加不同濃度配比的2,4—D和KT的MS培養(yǎng)基中,在愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)過程中,2,4—D設(shè)3個(gè)濃度梯度,KT設(shè)3個(gè)濃度梯度。出愈率為培養(yǎng)30 d后誘導(dǎo)出愈傷的外植體數(shù)與接種外植體數(shù)之比。

    1.2.5 不定芽的誘導(dǎo) 將誘導(dǎo)出的愈傷組織切塊,接種于附加不同濃度配比的6—BA和NAA的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),觀察愈傷組織的生長(zhǎng)情況。愈傷組織的誘導(dǎo)分化試驗(yàn)設(shè)計(jì)中6—BA設(shè)5個(gè)濃度梯度,NAA設(shè)2個(gè)濃度梯度。分化率為培養(yǎng)30 d后分化的愈傷組織數(shù)與接種愈傷組織數(shù)之比。

    1.2.6 腋芽增殖 將經(jīng)過處理的腋芽接種于添加不同濃度配比的6—BA和KT的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),觀察腋芽增殖過程中所發(fā)生的變化。其中帶腋芽的莖段分為平放和豎插兩種方式。在試驗(yàn)過程中,6—BA設(shè)5個(gè)濃度梯度,KT設(shè)2個(gè)濃度梯度。增殖率為培養(yǎng)30d后總的腋芽數(shù)目與最初接種時(shí)的腋芽數(shù)目的比值。

    1.2.7 根的誘導(dǎo) 待叢芽長(zhǎng)至2~3 cm時(shí),切割分離,轉(zhuǎn)入不同濃度配比的IAA和NAA的MS培養(yǎng)基上,誘導(dǎo)生根。NAA和IAA均設(shè)3個(gè)濃度梯度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同消毒時(shí)間對(duì)不同外植體的影響

    用70%酒精和0.1%升汞溶液對(duì)光皮樹的莖段、頂芽、葉片分別進(jìn)行消毒處理,不同處理時(shí)間的效果見表1。

    表1 不同消毒試劑和消毒時(shí)間對(duì)外植體的影響Tab.1 Effects of different sterilization reagent and sterilization time on explants

    表1結(jié)果顯示:單獨(dú)使用升汞消毒時(shí),各外植體的污染率最高,如莖段污染率達(dá)到15%,而與酒精配合使用后,污染率有明顯下降,當(dāng)酒精中浸泡時(shí)間為30 s時(shí),莖段污染率下降至10%。這是因?yàn)楣馄淝o段、頂芽和葉片表面都有細(xì)柔毛,而70%的酒精穿透力較強(qiáng),能短時(shí)間滲透消毒,故與升汞搭配使用較為適宜。隨酒精和升汞溶液中消毒時(shí)間的延長(zhǎng),外植體的污染率呈下降趨勢(shì),而褐化漸趨明顯,褐化率上升。從表1中結(jié)果看出,莖段作為外植體時(shí),在酒精中浸泡30 s后清洗,再于升汞溶液中消毒4~6 min時(shí),材料的污染率較小,且褐化率相對(duì)較低,最佳的消毒時(shí)間為70%酒精30 s,0.1%升汞9 min;頂芽最佳的消毒時(shí)間為70%酒精30 s,0.1%升汞4 min;而葉片表面柔毛較多,故70%酒精60 s后0.1%升汞中處理4 min,能達(dá)到較理想的效果。

    2.2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

    光皮樹愈傷組織誘導(dǎo)頻率與外植體來源有直接關(guān)系。六種外植體在接種到不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比的培養(yǎng)基中,均能誘導(dǎo)出愈傷組織,但誘導(dǎo)條件和愈傷組織的生長(zhǎng)情況不盡相同。(見表2)葉片在第8天開始卷曲,切口邊緣開始長(zhǎng)出亮白色的愈傷組織 (圖1a);莖段在第4天開始啟動(dòng) (圖1b),10 d后長(zhǎng)出淡黃色致密愈傷組織,生長(zhǎng)迅速 (圖1c);頂芽啟動(dòng)稍晚些,但生長(zhǎng)較快,后期長(zhǎng)勢(shì)良好 (圖1g)。

    結(jié)果表明:2,4—D濃度在1~4 mg/L范圍內(nèi)隨著濃度的增加,愈傷組織的誘導(dǎo)率呈上升趨勢(shì),但2,4—D濃度過高 (4 mg/L)抑制愈傷組織的產(chǎn)生,導(dǎo)致愈傷組織出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。當(dāng)2,4—D和KT濃度分別為2 mg/L和0.5 mg/L時(shí),愈傷組織的誘導(dǎo)率較高。其中莖段在最適培養(yǎng)基上出愈率最高,達(dá)到90%,愈傷組織質(zhì)地致密顏色淡黃綠色,生長(zhǎng)速度較快 (圖1c);葉片的出愈率次之,后期達(dá)到89%,愈傷組織質(zhì)地疏松顏色發(fā)白 (圖1a);子葉的出愈率達(dá)到88%,形成了質(zhì)地疏松,淡黃色愈傷組織,后期呈現(xiàn)玫瑰紅色(圖1d);帶腋芽的莖段出愈率達(dá)到84%,形成了疏松,玻璃化的愈傷組織 (圖1e);胚軸的出愈率達(dá)到81%,形成了疏松玻璃化的愈傷組織 (圖1f);頂芽的出愈率也達(dá)到85%,形成了致密,淡黃色的愈傷組織(圖1g)。

    表2 不同濃度組合植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.2 Effects of different plant growth substances combination on callus induction

    圖1 光皮樹不同外植體的愈傷組織 (一)Fig.1 The callus of different explant of S.wilsoniana(a)

    2.3 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合對(duì)愈傷組織分化的影響

    將切塊的愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基 (MS+6BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L和MS+6BA 4.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L)中進(jìn)行培養(yǎng),20 d后發(fā)現(xiàn)由葉片、胚軸、子葉和帶腋芽的莖段長(zhǎng)出的愈傷組織均呈現(xiàn)玻璃化和黏液化現(xiàn)象。而由莖段長(zhǎng)出的愈傷組織質(zhì)地依然致密,顏色淡黃綠色。因此,將由莖段誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)入不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度配比的培養(yǎng)基上,35 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織上的不定芽分化率并記錄愈傷組織的變化情況。結(jié)果見表3。

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:由莖段誘導(dǎo)出的愈傷組織接種于上述供試培養(yǎng)基中均未分化。隨著6—BA濃度的升高,愈傷組織的質(zhì)地由疏松變化成稍致密,顏色由透明變?yōu)闇\黃色再到淺黃綠色,為分化提供了可能性。6—BA(4.0 mg/L)和NAA(0.5 mg/L)稍有利于致密淺黃綠色愈傷組織的繼代培養(yǎng)。

    表3 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合對(duì)不定芽分化的影響Tab.3 The concentration of different growth regulator combinations on the differentiation of adventitious buds

    2.4 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合對(duì)光皮樹腋芽增殖的影響

    將光皮樹帶腋芽的莖段接種于不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度配比的培養(yǎng)基中,接種方式分為平放和豎插。觀察腋芽增殖的情況,并記錄。結(jié)果見表4。

    表4 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度配比對(duì)腋芽增殖的影響Tab.4 Different growth regulators and their concentration ratio on the impact of axillary bud proliferation

    表4結(jié)果表明:帶腋芽的莖段在進(jìn)行平放和豎插時(shí),二者的增殖系數(shù)相差無幾。6—BA的濃度處于1.0 mg/L和8.0 mg/L時(shí),腋芽的增殖系數(shù)較低。從總體上來看,隨著6—BA濃度的增大,增殖系數(shù)先增后降。6—BA濃度為4.0 mg/L、KT為0.5 mg/L時(shí),兩種接種方式的增殖系數(shù)均最高,平放時(shí)可達(dá)3.4。帶腋芽的莖段平放時(shí),接種4 d后腋芽開始萌動(dòng),呈淺嫩綠色且莖段基部膨大,10 d后在腋芽基部周圍產(chǎn)生數(shù)量不等的叢芽數(shù) (2~6個(gè))(圖2a);豎插時(shí),接種6 d后腋芽開始萌動(dòng),15 d后產(chǎn)生數(shù)量不等的叢芽數(shù) (1~5個(gè))。其中平放時(shí)莖段腋芽增殖效果較好,生長(zhǎng)明顯,長(zhǎng)勢(shì)旺盛,莖段健壯 (圖2c)。

    圖2 光皮樹不同外植體的愈傷組織 (二)Fig.2 The callus of different explant of S.wilsoniana(b)

    2.5 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合對(duì)生根的影響

    將叢芽轉(zhuǎn)接入供試生根培養(yǎng)基中,叢芽基部逐漸褐化或未見根的分化。其原因可能是因?yàn)楣馄錇槎嗄晟颈局参铮嗄晟颈局参锲毡榇嬖谏^困難或生根時(shí)間較長(zhǎng)等現(xiàn)象[9]。另外供試生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度組合可能不適宜光皮樹的生根培養(yǎng)。

    3 討論

    3.1 子葉和胚軸接種方式對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

    在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),子葉和胚軸誘導(dǎo)愈傷過程中,子葉和胚軸平放對(duì)誘導(dǎo)愈傷較好,這可能是因?yàn)樽尤~和胚軸平放,能充分接觸培養(yǎng)基,從中吸收養(yǎng)分,接受生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的誘導(dǎo),因此兩端切口處的出愈率高,愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)較好;當(dāng)子葉和胚軸插入培養(yǎng)基,僅切面細(xì)胞接觸,吸收及接受生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)的面積小,向上運(yùn)輸養(yǎng)分和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑困難,導(dǎo)致子葉和胚軸出愈率下降。在子葉和胚軸誘導(dǎo)不定芽再生過程中,僅僅產(chǎn)生愈傷,均未誘導(dǎo)出芽點(diǎn),可能是細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的比值影響了芽的分化,需要進(jìn)一步探索誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基。

    3.2 外植體類型與愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)系

    來源于光皮樹不同部位的愈傷組織在結(jié)構(gòu)和顏色及生長(zhǎng)特性等方面都有明顯的差異。本試驗(yàn)以葉片、莖段、頂芽、子葉、胚軸和帶腋芽的莖段為外植體進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo),該愈傷組織質(zhì)地疏松,在添加較高濃度的6—BA與適量NAA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,以莖段為外植體時(shí),能在切口處膨大產(chǎn)生質(zhì)地稍硬的致密愈傷組織,顏色變成淺黃綠色。在同樣的培養(yǎng)條件下,葉片、頂芽、子葉和胚軸等外植體卻只能誘導(dǎo)出愈傷組織,顏色一般為透明,質(zhì)地疏松。分析其原因,可能是不同部位外植體的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞類型不同,它們產(chǎn)生愈傷組織所需要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)種類和所需量也有很大的差別。故以莖段為外植體,愈傷組織的啟動(dòng)能力明顯比其他外植體強(qiáng),誘導(dǎo)時(shí)間短于其他外植體的誘導(dǎo)時(shí)間,且愈傷組織生長(zhǎng)速率快,細(xì)胞分裂時(shí)間短,這與有關(guān)報(bào)道所述光皮樹植株幼嫩莖段細(xì)胞分裂旺盛,易于再分化[10]相符。

    3.3 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)外植體愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響

    植物組織培養(yǎng)的愈傷組織分化過程是生長(zhǎng)素含量逐步降低、細(xì)胞分裂素含量逐步升高的過程。本實(shí)驗(yàn)中愈傷組織未能分化,一種可能是由于還不了解光皮樹自身激素的狀況,沒有找到適合誘導(dǎo)分化的細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比值;另外一種可能是由于高質(zhì)量濃度的2,4—D對(duì)外植體及愈傷組織的傷害。一些研究者認(rèn)為,盡管較高質(zhì)量濃度的2,4-D有利于胚性愈傷組織的誘導(dǎo),但高質(zhì)量濃度的2,4—D使整個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)比例始終處于高比例的生長(zhǎng)素類似物狀態(tài),從而不利于隨后進(jìn)行的愈傷組織分化再生芽的過程[11-12];第三種可能是由于所誘導(dǎo)的愈傷組織屬于非胚性愈傷組織,這與有關(guān)資料所述的“非胚性愈傷組織分化率低,甚至不分化”的觀點(diǎn)相符合[12-13]。

    4 結(jié)語(yǔ)

    本文分別從光皮樹愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖、分化和腋芽增殖等途徑進(jìn)行研究,各外植體均能誘導(dǎo)愈傷組織,但不定芽分化困難,在愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的途徑中,愈傷組織在分化培養(yǎng)基上相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)形態(tài)上幾乎沒有變化。有研究者認(rèn)為初代培育時(shí)培養(yǎng)基配方中的酸性物質(zhì)使外植體處于酸性環(huán)境中并導(dǎo)致植物正常細(xì)胞首先發(fā)生細(xì)胞壁酸性降解,隨后出現(xiàn)原生質(zhì)體脫離細(xì)胞壁,進(jìn)一步發(fā)生細(xì)胞器重組或細(xì)胞重建[14]。在愈傷組織形成后,如果轉(zhuǎn)移過早,還未形成成熟的脫分化組織;過晚,愈傷組織可能褐化或喪失進(jìn)一步分化的能力。所以探索出合適愈傷組織的轉(zhuǎn)移及其分化時(shí)刻也是間接誘導(dǎo)不定芽途徑中非常重要的工作環(huán)節(jié)。今后還應(yīng)在繼代培養(yǎng)、不同時(shí)期的愈傷組織細(xì)胞切片以及次生代謝物方面作深入的研究,從而在生理的基礎(chǔ)上,了解其生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)制。特別是如能從分子水平上檢測(cè)光皮樹不同發(fā)育階段對(duì)各種理化因子的需求,以及通過探索光皮樹不同生長(zhǎng)期對(duì)各種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的應(yīng)答機(jī)制,了解不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑之間和光皮樹的相互作用,從而建立一套完整的離體培養(yǎng)體系。這將對(duì)實(shí)現(xiàn)光皮樹工廠化育苗及進(jìn)一步利用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)高油含量光皮樹遺傳轉(zhuǎn)化奠定技術(shù)基礎(chǔ),具有重要實(shí)踐意義。

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