安定在保存血液中的分解動力學研究1)

溫昕娟,曹 潔,朱培培,張大明,贠克明

安定是臨床上常用的鎮(zhèn)靜催眠藥,但長期服用或大量服用均可引起中毒,安定中毒的案例時有報道[1-3]。本研究建立安定灌胃中毒致死犬的動物模型,研究安定在保存犬血液中的分解動力學。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器和試劑 T race DSQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Finnigan公司;島津2010GC氣相色譜儀,日本島津公司;安定標準品(購于公安部二所);內(nèi)標:SKF525(中國標準技術(shù)開發(fā)公司);其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 實驗動物 本地雜種犬6只,15 kg～20 kg,雄性,山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制 安定、內(nèi)標儲備液的配制:分別精密稱取安定、丙基解痙素(SKF525A,內(nèi)標物)標準品適量,用無水乙醇溶解并定量稀釋制成1.0 mg/mL的標準儲備液。

1.2.2 色譜分析條件 氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析條件:DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 mm)毛細管柱;載氣為高純氦氣,恒流模式,流速1.0 mL/min;進樣口溫度 250℃;柱溫為程序升溫:200℃(1 min)→20℃/min→280℃(6 min);傳輸線溫度 250℃;電子轟擊電離源(EI),電子能量70 eV,離子源溫度250℃;自動調(diào)諧方式,發(fā)射電流強度 100 μ A;掃描起始時間4 min,掃描范圍50 amu～650 amu;分流進樣,分流比為10∶1。氣相色譜分析條件:DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 mm)毛細管柱;載氣為高純氮氣,恒壓模式,壓力150 kPa;進樣口溫度:250℃;柱溫:200℃(1 min)→20℃/min→280℃(6 min);NPD檢測器,溫度 300℃;不分流進樣。

1.2.3 提取分離與檢測 血液 1 mL,加水3 mL,加入內(nèi)標物SKF52510 μ g,硼酸緩沖溶液調(diào)pH 為10,5 mL乙醚萃取,振蕩10 min,離心,取上清液4 mL置于干燥離心管中。乙醚重新萃取一次,合并有機相,40℃恒溫水浴中揮干。殘渣加20 μ L乙醇定容,取1 μ L進樣。保留時間結(jié)合特征離子峰定性,內(nèi)標法和標準曲線法(氣相色譜)定量。

1.2.4 保存犬血中的分解動力學 雄性犬6只,插胃管,2 min內(nèi)注入2 LD50劑量安定[4],每只犬血分4等份置于20℃、4℃、-20℃、20℃(加氟化鈉至濃度為1%)中,于0、7d、14d、28d,60 d、90 d、150 d、210 d檢測血液中安定含量。采用 WinNorLin藥代動力學軟件處理平均藥物濃度,擬合分解動力學方程,計算分解半衰期。

2 結(jié) 果

2.1 GC和GC/MS檢測 安定與內(nèi)標物及內(nèi)源性雜質(zhì)分離良好。詳見圖1～2。

2.2 工作曲線 取空白血分別添加安定0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0、32.0、48.0 μ g 按前述 2.1方法提取測定。所建立的血中安定檢測工作曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、最低檢出限分別為Y=3.0519X-2.8942(X為安定和內(nèi)標物峰面積比值 ;Y為安定含量 ,μ g/mL或μ g/g)、0.1～ 32μ g/mL、0.998 8μ g/mL 、0.05μ g/mL 。

2.3 回收率及精密度 精密吸取15份空白全血1 mL,分為3組,分別加水3 mL,混勻。每組分別加入安定0.5、1.0、4.0 μ g,按2.1全血樣品處理項方法處理測定。同時取1 d內(nèi)5次測定結(jié)果計算日內(nèi)相對標準差,以3 d內(nèi)5次測定結(jié)果計算日間相對標準差。詳見表1。

表1 安定提取回收率及精密度(n=5)

2.4 分解動力學研究

2.4.1 溫度對保存血液中安定濃度的影響(見表 2、表3)

表2 溫度對保存血液中安定濃度的影響(±s)μ g/mL 或μ g/g

表2 溫度對保存血液中安定濃度的影響(±s)μ g/mL 或μ g/g

時間(d)20℃ 4℃ -20℃ 20℃(1%NaF)0 102.376±8.560 102.376±8.560 102.376±8.560 102.376±8.560 102.205±6.078 78.724±7.870 87.258±6.620 113.112±4.382 28 90.128±5.637 67.507±5.3921) 64.951±3.0581) 95.906±1.466 56 56.874±2.1351) 31.511±4.4521) 18.520±1.0851) 41.235±6.3711)90 28.560±1.6331) 27.156±3.6401) 15.593±4.1091) 29.748±4.2381)150 26.357±4.4291) 19.632±1.5471) 12.155±3.4241) 19.839±2.0251)210 19.121±4.7991) 26.077±7.9191) 15.529±8.8161) 21.056±8.2331)方差分析,bonferroni法與0時相比,1)P＜0.05 7

表3 溫度對保存血液中安定下降百分比的影響(±s)%

表3 溫度對保存血液中安定下降百分比的影響(±s)%

時間(d)20℃ 4℃ -20℃ 20℃(1%NaF)0 100.0±8.3 100.0±8.3 100.0±8.3 100.0±8.3 99.8±6.1 76.8±7.6 85.2±6.4 110.4±4.2 28 88.0±5.5 65.9±5.21) 63.4±2.91) 93.6±1.4 56 55.5±2.11) 30.7±4.31) 18.0±1.01) 40.2±6.21)90 28.5±1.61) 26.5±3.51) 15.2±4.11) 29.2±4.11)150 27.8±1.51) 19.1±1.51) 11.8±3.31) 19.3±1.91)210 18.6±4.61) 25.4±7.71) 15.1±7.51) 20.5±8.01)方差分析,bonferroni法與0時相比,1)P＜0.05 7

2.4.2 分解動力學參數(shù)和方程 采用WinNorLin藥代動力學軟件處理平均藥物濃度-時間數(shù)據(jù)。其分解符合一級動力學過程,可用 Ct=C1e-αt+C2e-βt(Ct 為時間 t測得的含量;C1、C2表示初始含量;t表示時間,單位:天;α、β為一級分解速率常數(shù))。分解動力學方程和參數(shù)見表4。根據(jù)此方程計算的理論值與實測值符合情況見表4。

表4 不同保存條件下血液中安定分解動力學參數(shù)

表5 20℃、4℃、-20℃條件下血液中安定理論值與實測值比較

3 結(jié) 論

苯駢二氮雜卓類藥物在生物檢材中的穩(wěn)定性視母體藥物及其代謝物的結(jié)構(gòu)、存儲條件和防腐劑的添加有關(guān)[6]。室溫下血液和組織標本中安定、氟安定以及氟安定的分解產(chǎn)物N-1-脫羥基氟安定在幾個月內(nèi)是穩(wěn)定的,而安定的分解產(chǎn)物去甲安定不穩(wěn)定[7]。本實驗結(jié)果顯示,保存28 d～56 d時,犬血中安定含量下降至其初始濃度的55.5%～65.9%,保存210 d時下降至初始濃度的15.2%～25.5%。說明安定等苯駢二氮雜卓類藥物在全血和血漿中均可分解。

3.1 溫度對保存血液中安定濃度的影響 溫度對全血中苯駢二氮雜卓類藥物穩(wěn)定性的影響已有研究[8-10]。本實驗結(jié)果表明,室溫、4℃、-20℃保存210 d犬血中安定含量下降為其初始濃度的15.2%～25.5%,但三個溫度間無統(tǒng)計學意義。說明在室溫、4℃、-20℃保存時溫度對全血中安定穩(wěn)定性的影響不大。

3.2 防腐劑對保存血液中安定濃度的影響 本實驗結(jié)果顯示,-20℃添加1%氟化鈉保存28 d～150 d犬血中安定含量顯著高于4℃、-20℃保存犬血中安定濃度,但保存210 d時各組間無統(tǒng)計學意義。說明抑菌劑對保存血液樣本安定穩(wěn)定性也有較小影響,可輕度抑制其中安定的分解。這也可能與本研究采用活體采血,血樣細菌污染少有關(guān)。

3.3 WinNorLin軟件擬合結(jié)果分析 血中平均藥物濃度-時間數(shù)據(jù)擬合結(jié)果顯示,保存全血中安定的分解動力學符合一級動力學過程,可用 Ct=C1e-αt+C2e-βt表示。用此公式計算的安定血濃度理論值與實測值非常接近,說明應(yīng)用血中安定分解動力學數(shù)學模型和參數(shù),可以推測血中藥物濃度的經(jīng)時變化,推斷中毒死亡當時或檢材采集當時尸體或檢材中藥物含量,指導(dǎo)選擇最佳檢材存放條件,正確分析和使用毒物分析結(jié)果。

本實驗證明安定在保存血液樣品中可分解,保存溫度和抑菌劑對其影響較小。安定中毒案件法醫(yī)學鑒定中所采血樣應(yīng)于28 d內(nèi)送檢和檢驗,否則可用其分解動力學方程和參數(shù)推斷中毒死亡或檢材采集當時的血藥濃度。

[1]Wolf CE,Poklis A.A rapid HPLC procedure for analysis of analgesic pharmaceutical mixtures for quality assurance and drug diversion testing[J].Anal T oxicol,2005,29(7):711-714.

[2]鄭虎.藥物化學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:100.

[3]陸基宗.學生濫用安定類藥物有害[J].家庭醫(yī)學,2006,2:16.

[4]鄧小明,朱科明.常用實驗動物麻醉[M].上海:第二軍醫(yī)大學出版社,2001:21.

[5]李玉蘭,徐建寧,劉耀.生物試樣中安定、利眠寧、舒寧藥物及其代謝降解物的GC/MS分析[J].現(xiàn)代儀器,1999(5):12-15.

[6]李云,贠克明.生物檢材中常見法醫(yī)毒物的分解動力學[M].第四屆全國法醫(yī)毒物分析學術(shù)交流會論文選,海潮出版社,2008:100-103.

[7]譚家鎰,姜兆林.肝、尿中安定等4種藥物的固相萃取-紫外導(dǎo)數(shù)光譜檢測法[J].分析化學,1999,27(11):1317-1319.

[8]Skopp G,Potsch L,Konig I,et al.A preliminary study on the stability of benzodiazepines in blood and plasma stored at 4 degrees C[J].International J Legal Med,1998,111(1):1-5.

[9]ElM ahjoub A,Staub C.Stability of benzodiazepines in whole blood samples stored at varying temperatures[J].J Pharmaceutical&Biomedical Analysis,2000,23(6):1057-1063.

[10]Robertson MD,Drummer OH.Postmortem distribution and redistribution of nitro benzodiazepines in man[J].Forensic Sci,1998,43(1):5-13.