原花青素交聯(lián)牛心包材料的研究

萬(wàn)榮欣 田 聰 劉 欣 顧漢卿*

1(天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070)

2(天津市泌尿外科研究所，天津 300211)

引言

心臟瓣膜疾病在臨床上有很高的致死率，人工生物瓣膜置換術(shù)是治療心臟瓣膜病的有效的手段之一［1］。目前，臨床上應(yīng)用的生物心臟瓣膜都是戊二醛(glutaraldehyde，GA)處理的豬主動(dòng)脈瓣或牛心包制成的，由于易鈣化、易衰敗、耐久性差等問(wèn)題限制其在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用［2－5］。有研究表明，引起瓣膜鈣化、造成瓣膜耐久性差的原因是戊二醛的應(yīng)用［1］。因此，人們開(kāi)始探索其他的交聯(lián)劑，如多聚環(huán)氧化合物、碳化二亞胺、京尼平等理想的交聯(lián)劑應(yīng)具有毒性低，處理后的瓣膜具有優(yōu)良力學(xué)性能、穩(wěn)定性和耐久性［2］。上述交聯(lián)劑還未能完全滿足生物心臟瓣膜的需要。

原花青素(procyanidins，PA)是一類(lèi)廣泛存在于水果、蔬菜、花瓣、種子以及樹(shù)皮中的植物次生代謝產(chǎn)物［6，7］，也是紅葡萄酒的重要成分，其體內(nèi)代謝途徑清楚［8］，而且沒(méi)有毒性。運(yùn)用原花青素制備心臟瓣膜材料的研究文獻(xiàn)報(bào)道還不多，因此本研究目的探討原花青素處理的瓣膜材料的性能。按照生物型心臟瓣膜的標(biāo)準(zhǔn)以及臨床需要對(duì)生物瓣膜材料進(jìn)行以下幾個(gè)方面的研究:交聯(lián)特性、力學(xué)特性、抗酶降解性能、親水性能、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及溶血試驗(yàn)等。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

戊二醛(Kermel，天津)、原花青素(尖峰天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)有限公司，天津)、Ⅰ型膠原酶(Gibco，USA)、茚三酮(Kermel，天津)、氣浴恒溫振蕩器(蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司，SHZ-82B)、EnduraTEC ELF3200生物力學(xué)測(cè)試儀(Bose公司)、Perkin-Elmer DSC-7熱變性分析儀、722S型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 瓣膜材料的制備

取屠宰場(chǎng)新鮮的健康成年黃牛心包膜，置入4℃生理鹽水中帶回實(shí)驗(yàn)室，剔除外周脂肪，取無(wú)損傷、厚度均勻的前壁部分修剪為3 cm×4 cm的小片，磷酸緩沖液(PBS)溶液充分漂洗。熱缺血時(shí)間控制在6 h以內(nèi)。將修剪好的牛心包組織放入0.625%的戊二醛溶液和0.5%的原花青素溶液中，37℃搖床交聯(lián)72 h。將對(duì)以下三組材料性能檢測(cè):新鮮牛心包組(fresh)、戊二醛組(GA)、原花青素組(PA)。

1.2.3 材料檢測(cè)方法1.2.3.1 厚度

用螺旋測(cè)微器對(duì)脫細(xì)胞及交聯(lián)前后的組織厚度進(jìn)行測(cè)量，考察交聯(lián)前后組織的大體形態(tài)學(xué)變化(n=14)。

1.2.3.2 材料的親水性檢測(cè)

含水量測(cè)試:將濕態(tài)樣品夾在兩層干濾紙中間，濾紙上壓一重50 g的物體30 s，測(cè)得樣品濕重;將樣品真空冷凍干燥24 h測(cè)得干重。按式(1)計(jì)算樣品的含水率。

接觸角測(cè)試:接觸角是表征材料表面親水性能的重要參數(shù)之一，本實(shí)驗(yàn)采用 JC2000C1接觸角測(cè)試儀考察樣品的表面親水性能，每個(gè)樣品取五個(gè)平行樣。

1.2.3.3 力學(xué)性能測(cè)試

將樣品沿纖維走向剪成1 cm×4 cm的長(zhǎng)條狀，用EnduraTEC ELF3200生物力學(xué)測(cè)試儀固定兩端，預(yù)留長(zhǎng)度15 mm，按10 mm/min的加載速度對(duì)樣品進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.3.4 交聯(lián)指數(shù)的測(cè)定

自由氨基酸與茚三酮溶液在100℃下共熱生成藍(lán)紫色溶液，且自由氨基酸含量與藍(lán)紫色溶液的光吸收值成正相關(guān)。具體方法如下:將0.02 g干重組織與1 mg/mL的茚三酮溶液沸水浴15 min，用牛血清白蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線，722型可見(jiàn)分光光度計(jì)在440 nm下測(cè)定光吸收值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算組織中自由氨基酸的含量。按式(2)計(jì)算交聯(lián)指數(shù)。

1.2.3.5 變性溫度測(cè)定

將樣品剪碎成約 1 mm×1 mm的小片，用Perkin-Elmer DSC-7熱變性分析儀對(duì)樣品進(jìn)行DSC掃描分析，升溫范圍為40℃ ～130℃，升溫速率為10℃ /min。

1.2.3.6 體外降解

采用添加了雙抗的0.05 mg/mL的Ⅰ型膠原酶溶液作為降解液，取約0.02 g干重組織，按組織重量(mg):降解液用量(m l)=1∶0.5添加，37℃恒溫震蕩，凍干稱重。降解率按照式(3)計(jì)算。

1.2.3.7 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 16886.5－2003和 GB/T 16175－2008進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)，方法如下:分別取各組材料2 g剪成1 cm×2 cm，Co60滅菌后，浸于10 mL含有血清的1640培養(yǎng)液中37℃靜置72 h，將濃度為2×104個(gè)/ml的L929細(xì)胞懸浮液加入在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔1 mL，培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液棄之，分別加入樣品浸提液、陰性對(duì)照(1640培養(yǎng)液)、陽(yáng)性對(duì)照(含有0.5%苯酚的培養(yǎng)液)各組溶液分別1 mL，并將培養(yǎng)板培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 1、3、5 d，甲醛固定，結(jié)晶紫染色、SDS(十二烷基苯磺酸鈉)抽提，722分光光度計(jì)測(cè)定各組吸光度值(波長(zhǎng)為588 nm)。

根據(jù)下面式(4)計(jì)算。

表1是細(xì)胞增殖度法的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，按照表1進(jìn)行細(xì)胞毒性分級(jí)。

表1 細(xì)胞毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 The evaluation standard of cytotoxicity

1.2.3.8 溶血試驗(yàn)

按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14233.2－2005進(jìn)行溶血試驗(yàn)的方法如下:取各組樣品5 g，分別加入10 mL生理鹽水，陰性對(duì)照為10 mL生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照為10 mL蒸餾水，(37±1)℃保溫30 min，加稀釋兔血0.2 mL，37℃保溫60 min。取管內(nèi)液體離心1 000 r/min，10 min，在545 nm波長(zhǎng)下測(cè)上清液的吸光度并記錄結(jié)果。按式(5)計(jì)算材料的溶血率.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 厚度結(jié)果

新鮮牛心包組織經(jīng)過(guò)戊二醛或原花青素處理后的厚度的變化見(jiàn)表2，由表2可見(jiàn):牛心包材料經(jīng)過(guò)戊二醛或原花青素交聯(lián)固定處理后厚度都會(huì)顯著增加(P＜0.05)，戊二醛或原花青素處理的牛心包組織的厚度未見(jiàn)顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 親水性結(jié)果

新鮮牛心包組織經(jīng)過(guò)不同方法處理后的含水量以及表面接觸角比較結(jié)果見(jiàn)表3，可見(jiàn):牛心包組織經(jīng)過(guò)戊二醛交聯(lián)后，含水量未見(jiàn)明顯變化(P＞0.05);原花青素交聯(lián)固定的牛心包材料含水量減少(P＜0.05)。材料的表面親、疏水性能可由材料表面接觸角來(lái)說(shuō)明，經(jīng)過(guò)戊二醛或原花青素處理后的牛心包表面的親水性能顯著增強(qiáng)，接觸角減小，而GA組和PA組之間未見(jiàn)顯著性差異。

表2 GA和PA交聯(lián)組織厚度變化比較(n=14)Tab.2 Thickness of group Fresh，group GA and group GP(n=14)

表3 各組牛心包組織含水量和接觸角比較(n=5)Tab.3 The contrast of mositure content and contact angle(n=5)

2.3 力學(xué)性能檢測(cè)結(jié)果

表4是牛心包材料經(jīng)過(guò)不同方法處理后的力學(xué)性能的結(jié)果。由表4可見(jiàn)，戊二醛交聯(lián)后的牛心包組織斷裂強(qiáng)度和新鮮牛心包組織比較未見(jiàn)顯著性差異(P＞0.05)，而經(jīng)過(guò)原花青素交聯(lián)后的牛心包組織的斷裂應(yīng)力明顯高于GA交聯(lián)組和新鮮牛心包組(P＜0.05);經(jīng)過(guò)戊二醛或原花青素交聯(lián)固定的牛心包組織的伸長(zhǎng)率和新鮮牛心包組未見(jiàn)顯著性差異;但牛心包組織經(jīng)過(guò)戊二醛或原花青素交聯(lián)后彈性模量都明顯增加(P＜0.05)，原花青素交聯(lián)后組織彈性模量高于戊二醛交聯(lián)組織(P＜0.05)，可見(jiàn)牛心包材料經(jīng)過(guò)原花青素交聯(lián)后質(zhì)地會(huì)變硬。

表4 各組牛心包組織力學(xué)性能檢測(cè)結(jié)果(n=4)Tab.4 The contrast of fracture stress，break elongation and elastic modulus(n=4)

2.4 交聯(lián)特征

經(jīng)過(guò)不同方法處理后材料的交聯(lián)度和變性溫度結(jié)果見(jiàn)表5。通過(guò)茚三酮比色法測(cè)得的各組交聯(lián)度結(jié)果可知:戊二醛交聯(lián)組交聯(lián)度較高，達(dá)到98.64%，而經(jīng)過(guò)原花青素交聯(lián)的組織的交聯(lián)度僅為48.24%，交聯(lián)度明顯低于戊二醛，這可能與交聯(lián)度檢測(cè)時(shí)的高溫加熱有關(guān)。而經(jīng)過(guò)戊二醛或原花青素處理后的牛心包材料的變性溫度都明顯提高，而GA組和PA組比較未見(jiàn)顯著性差異(P＞0.05)。

表5 新鮮組、戊二醛交聯(lián)和原花青素交聯(lián)牛心包交聯(lián)度特性的比較(n=3)Tab.5 Crosslinking characteristics of fresh and procyanidin-and glutaraldehyde-fixed bovine pericardia(n=3)

2.5 體外降解結(jié)果

圖1是新鮮牛心包組、原花青素交聯(lián)組和戊二醛交聯(lián)組在膠原酶溶液經(jīng)過(guò)不同時(shí)間降解其失重率的變化。由圖1可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)戊二醛或原花青素交聯(lián)處理可以明顯降低牛心包組織的抵抗膠原酶降解的能力，新鮮牛心包組織在膠原酶溶液中浸泡8 d后失重率達(dá)到95%以上，而經(jīng)過(guò)戊二醛或原花青素的固定處理組織膠原酶溶液降解8 d失重率僅為2.87%和4.84%，兩種交聯(lián)劑交聯(lián)的牛心包組織在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的降解失重率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，未見(jiàn)顯著性差異(P＞0.05)。

2.7 細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果

新鮮組、PA組和GA組的材料細(xì)胞毒性結(jié)果如表6所示，可見(jiàn)，新鮮牛心包組織經(jīng)過(guò)戊二醛后，其浸提液于L929細(xì)胞共培養(yǎng)，L929細(xì)胞增殖率顯著下降，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖率逐漸減小，按照細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)均在2級(jí)和3級(jí)，細(xì)胞毒性較大;新鮮牛心包組織經(jīng)過(guò)原花青素交聯(lián)后，在浸提液與細(xì)胞共培養(yǎng)短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞增殖率較小(76.19%)，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的增殖率逐漸增加，第5 d時(shí)L929細(xì)胞相對(duì)陰性對(duì)照增值率達(dá)到100.12%，按照細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)接近0級(jí)?？梢?jiàn)經(jīng)原花青素和戊二醛交聯(lián)的組織經(jīng)過(guò)相同時(shí)間的清洗，PA組對(duì)L929細(xì)胞株的毒性較小。

2.8 溶血試驗(yàn)結(jié)果

各組牛心包材料溶血試驗(yàn)的結(jié)果如見(jiàn)表7所示，可知，新鮮牛心包組織經(jīng)過(guò)戊二醛或原花青素交聯(lián)后，溶血率顯著下降，而原花青素交聯(lián)的牛心包組織的溶血率是最小的，符合溶血率小于5%的標(biāo)準(zhǔn)，原花青素交聯(lián)的組織經(jīng)過(guò)相同時(shí)間的清洗，溶血率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于戊二醛交聯(lián)的組織。

表6 各組瓣膜材料浸提液對(duì)L929細(xì)胞株增殖率的影響及評(píng)級(jí)結(jié)果Tab.6 The effects of each sample extract derivatives to L929 cell

表7 各組牛心包材料溶血率的比較(n=3)Tab.7 The hemolysis rate of each group(n=3)

3 討論和結(jié)論

原花青素是一類(lèi)廣泛存在于水果、蔬菜、花瓣、種子以及樹(shù)皮中的植物次生代謝產(chǎn)物［6－7］，也是紅葡萄酒的重要成分，它被廣泛用于天然抗氧化劑、自由基清除劑、心血管系統(tǒng)的保護(hù)劑等等［9－10］，不僅如此，它還具有抗菌、抗病毒、抗癌、消炎等活性［11－12］。另外，原花青素未見(jiàn)急性和亞急性毒性反應(yīng)，并且其在體內(nèi)代謝途徑清楚［8］。哺乳動(dòng)物的心包組織是由膠原纖維組成的，Naimark等研究表明牛心包組織的膠原蛋白的含量約為80%［13］。由膠原組織制備的生物瓣膜在植入人體內(nèi)之前必須進(jìn)行交聯(lián)處理和滅菌處理。自20世紀(jì)60年代，戊二醛交聯(lián)技術(shù)作為一種被人們認(rèn)可的方法廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，但應(yīng)用中人們發(fā)現(xiàn)于戊二醛交聯(lián)制備的生物瓣不夠柔軟，容易在體內(nèi)工作時(shí)形成應(yīng)力集中，容易鈣化衰敗，造成生物瓣工作壽命不長(zhǎng)［14］。近來(lái)，Han等證實(shí)原花青素對(duì)膠原蛋白和以膠原蛋白為主要組成的組織有明顯的交聯(lián)作用，且皮下植入后未出現(xiàn)如戊二醛引起的細(xì)胞毒性、抑制膠原合成和鈣化現(xiàn)象［15］。

本研究中的生物瓣膜材料就是采用新鮮的黃牛心包，用對(duì)心腦血管有諸多益處的天然物質(zhì)原花青素為交聯(lián)劑，根據(jù)人工生物瓣膜材料的臨床應(yīng)用和人工心臟瓣膜的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 12779－2008對(duì)處理后的材料進(jìn)行性能表征，將與傳統(tǒng)的戊二醛固定技術(shù)作對(duì)比。

測(cè)定自由氨基官能團(tuán)的減少量和固定組織的變性溫度用來(lái)衡量交聯(lián)度，生物組織中自由氨基基官能團(tuán)的減少降低了它的抗原性［13］。本研究中發(fā)現(xiàn)新鮮牛心包組織經(jīng)過(guò)戊二醛或原花青素交聯(lián)處理后，變性溫度顯著提高，說(shuō)明戊二醛或原花青素交聯(lián)牛心包組織的膠原纖維和膠原蛋白更為穩(wěn)定，因此提高了固定組織的穩(wěn)定性。研究中發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)原花青素交聯(lián)的牛心包組織的交聯(lián)度比較低，分析可能與交聯(lián)度檢測(cè)過(guò)程中的高溫加熱有關(guān)。

雖然戊二醛或原花青素固定組織的厚度有所增加，但固定后組織的斷裂強(qiáng)度并未減小。所有經(jīng)過(guò)原花青素處理的牛心包組織的斷裂強(qiáng)度還顯著提高，原花青素交聯(lián)組織的無(wú)論斷裂強(qiáng)度還是伸長(zhǎng)率都優(yōu)于傳統(tǒng)交聯(lián)劑戊二醛。研究結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)原花青素處理的組織彈性模量較大，質(zhì)地比較硬，有研究表明將原花青素處理的組織放在D-Hanks液中浸泡15 d后，其彈性模量接近新鮮組織的彈性模量［16］。

體外酶降解是人們經(jīng)常用來(lái)考察交聯(lián)后膠原組織穩(wěn)定性的方法之一［17］。因?yàn)榕Ｐ陌M織中主要成分是 I型膠原，所以選擇 I型膠原酶作為酶降解實(shí)驗(yàn)的酶來(lái)考察材料的生物穩(wěn)定性。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明牛心包組織經(jīng)過(guò)原花青素處理后，其抵抗膠原酶降解的性能顯著提高，其效果和傳統(tǒng)交聯(lián)劑戊二醛比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此認(rèn)為經(jīng)過(guò)戊二醛或原花青素固定可以顯著提高組織的生物穩(wěn)定性。

生物學(xué)評(píng)價(jià)的內(nèi)容很多在ISO10993即G/BT16886系列標(biāo)準(zhǔn)中都有具體的規(guī)定，其中細(xì)胞毒性試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)是最敏感也是最基本的試驗(yàn)，所以本研究中選擇這兩種試驗(yàn)對(duì)生物瓣膜材料進(jìn)行初步生物學(xué)評(píng)價(jià)。運(yùn)用天然交聯(lián)劑原花青素或傳統(tǒng)交聯(lián)劑戊二醛制備的生物瓣膜材料經(jīng)過(guò)初步生物學(xué)檢測(cè)表明:經(jīng)過(guò)相同時(shí)間的清洗，原花青素固定組織的溶血率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)的戊二醛固定的組織;運(yùn)用細(xì)胞增殖度法進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果表明:原花青素交聯(lián)組織的浸提液在與L929細(xì)胞共培養(yǎng)短時(shí)間內(nèi)會(huì)影響其增殖速率(76.19%)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞的影響逐漸減小，在第7 d時(shí)細(xì)胞相對(duì)增值率達(dá)到100.12%。

綜上所述，經(jīng)過(guò)天然交聯(lián)劑原花青素處理的牛心包組織的穩(wěn)定性、力學(xué)特性、表面親水性能和抗酶降解能力都顯著提高，與傳統(tǒng)交聯(lián)劑戊二醛相比穩(wěn)定性、力學(xué)特性、親水性能和抗酶降解能力相當(dāng)，最大斷裂強(qiáng)度提高，固定組織的毒性也顯著降低。初步研究表明原花青素作為制備人工生物心臟瓣膜材料的新方法，具有很好的研究前景。

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