固載去甲萬古霉素緩釋微球疝補片的制備與表征

高麗麗 劉飛德 呂 豐 劉天軍*

1(中國醫(yī)學科學院＆北京協和醫(yī)學院 生物醫(yī)學工程研究所院，天津 300192)

2(中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬(304)醫(yī)院普外科，北京 100037)

引 言

腹壁疝是腹腔臟器連同腹膜經腹壁薄弱處或孔隙突出所致，各種年齡均可能發(fā)生。傳統的疝修補手術具有手術復雜、術后較長時間局部疼痛、易復發(fā)等諸多缺點，于是無張力疝修補技術應運而生［1－2］，即外科手術置入補片，通過補片本身的直接加固及日后組織細胞在網孔上生長的再次加固，達到加強腹股溝管后壁的目的［3］。手術中使用的補片分為生物材料補片和生物補片兩大類，又以前者使用居多。生物材料補片以聚合體為主要基礎材料，主要有三類:聚丙烯、聚酯和聚四氟乙烯［4］，其中聚丙烯(PP)材料是當今研究熱點。聚丙烯補片充填式修補疝是治療腹股溝疝安全、有效的方法，具有創(chuàng)傷小、恢復快等優(yōu)點，較傳統疝修補術有著明顯優(yōu)勢，已逐漸被廣大外科醫(yī)生所接受［5］。然而，疝修補術后補片感染時有發(fā)生［6］。據國外統計，使用補片的感染率約為1% ～8%［7］。同樣，術后感染現象在國內也存在［8］。目前，預防感染的方法有多種，Aufenacker等研究表明，手術前靜脈注射抗菌藥物效果不明顯［9］，Praveen等研究表明，局部使用慶大霉素與靜脈內給藥，對于預防疝修補術后感染具有同等效果［10］。Aguilaret等提出經皮穿刺引流抗菌藥物可作為一種傳統抗疝修補術后感染的方法［11-12］，但是這種方法給患者治療帶來不便。術前預防雖然可以很好地防范術中的細菌感染，但是不能避免術后發(fā)生的感染［13］，而且補片植入部位的感染一般具有遲發(fā)性。因此，提高補片的持久抗感染性能變得尤為重要。目前的研究主要集中在往材料中加入一定的抗菌藥物，以增加補片的抗感染能力［14］，因而發(fā)展攜帶抗菌藥物的補片成為國內外學者的共識。Cakmak等制備固載有含三氯生的殼聚糖凝膠的補片［15］，Karem等研究制備載有萬古霉素的改性 β-環(huán)糊精的補片來達到抗菌的目的［16］。

造成補片感染的細菌以金葡菌最常見。目前，鹽酸去甲萬古霉素是我國自主開發(fā)的糖肽類抗生素，其抗菌譜、抗菌活性及臨床療效都與萬古霉素相似，并且與其他抗生素無交叉耐藥性，故成為目前治療耐藥葡萄球菌感染的首選用藥。因此，篩選鹽酸去甲萬古霉素為模型藥物來達到補片抗菌的效果。

聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是一種具有生物可降解性的合成高分子材料。由于其易于合成、質量穩(wěn)定，具有生物惰性、生物可降解性、降解速度可調節(jié)性和良好的可塑性，近10余年來被大量用做微球控釋系統的骨架材料［17］。微球是一種理想的載藥制劑，其制備方法包括乳化溶劑揮發(fā)法、噴霧干燥法、低溫噴霧萃取法等［18］。乳化溶劑揮發(fā)法是將不相混溶的兩相通過機械攪拌或超聲乳化制成乳劑，揮發(fā)除去內相溶劑，析出成球材料，固化成微球［18］，它適用于包埋水溶性藥物并且有較高的包封率，所以本研究采用此方法制備鹽酸去甲萬古霉素聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球(NV-PLGA-MP)。

本研究選用國產抗生素鹽酸去甲萬古霉素(NV)作為模型藥物，以臨床常用疝氣修復補片PP為載體，應用載藥微球技術，研制了具有緩釋效果的固載鹽酸去甲萬古霉素聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球的聚丙烯補片(NV-PLGA-MP-PP)，并觀察其形態(tài)學特征、考察包載情況、載藥量和體外釋藥，探討其應用前景。

1 材料和方法

1.1 材料

鹽酸去甲萬古霉素(NV，華北制藥)，聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA，50∶50，Mw=45 000，中國科學院成都有機化學有限公司)，聚乙烯醇(PVA，聚合度-醇解度:05-88，中石油四川聚乙烯醇工廠)，乙烯-醋酸 乙 烯 (EVA，FM 114.1，d 0.941，Sigma-Aldrich，美 國)，聚 丙 烯 補 片 (Ethiconproduct，PCDM1.01)，其他試劑均為市售分析純或色譜純。高壓勻質機(ULTRA-TURRAX，T18basic，IKA公司，德國)，恒速攪拌機(RW20.n型，IKA公司，德國)，離心機(Eppendorf Centrifugation 5810R，Eppendorf公司，德國)，掃描電鏡(JSM-6700，JEOL株式會社，日本)，高效液相(Waters 1525泵，2487紫外檢測器，Waters公司，美國)，差示掃描量熱儀(DSC 2910型，TA 公司，美國)，凍干機(Free Zone，Labconco公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 NV-PLGA-MP的制備

采用復乳溶劑揮發(fā)法，制備 NV-PLGA-MP。將鹽酸去甲萬古霉素水溶液(40 mg/mL)作為內水相;將PLGA溶于 CH2Cl2，形成濃度為4%PLGA溶液作為油相;按體積比1:5將內水相加入到油相中，室溫，高壓勻質機以轉速11 000 r/min勻質30 s，形成初乳(W/O);以 PVA作為乳化劑，制備成濃度為1%PVA水溶液為外水相;將初乳倒入外水相中，初乳與外水相體積比為1:5，形成復乳(W/O/W)，室溫，以轉速500 r/min恒速攪拌機攪拌4 h，揮發(fā)有機溶劑，經離心、洗滌、冷凍干燥，得到白色抗感染NV-PLGA-MP。

1.2.2 微球的形態(tài)特征及粒徑分布

將凍干粉置于金屬片上，噴金形成薄膜，置于掃描電鏡(SEM)下觀察其表面形態(tài);對掃描電鏡圖片進行分析，從中選取3張，每張隨機選取50個微球進行粒徑分析;利用Image J(National Institutes of Health)，求出微球的算術平均粒徑。

1.2.3 微球中NV的含量測定

參考中華人民共和國2005年藥典，利用HPLC法［11］，檢測微球中的 NV 含量。

1.2.3.1 HPLC方法學的建立

1)色譜條件:柱子為 Kromasil'C18(200×4.6 mm，5 μm，十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑)，流動相為0.132%磷酸氫二銨水溶液(磷酸調節(jié)pH值至6.0)－甲醇 (74∶26)，流速為 1 mL/min，檢測波長為 254 nm，進樣量為 20 μL。

2)特異性:精密稱量NV，用蒸餾水配制濃度為0.1 mg/mL的 NV 溶液，進樣20 μL，記錄色譜圖;精密稱量NV-PLGA-MP樣品溶于二氯甲烷中，用一定體積(V)的去離子水提取去甲萬古霉素，水相進樣20 μL，記錄譜圖。

3)線性:精密稱量 NV，用蒸餾水配制濃度為0.1 mg/mL的NV溶液，作為儲備液。稀釋成濃度為 0.06、0.04、0.02、0.01、0.005 mg/mL 的 NV 溶液，分別進樣，每樣重復3次，積分計算其峰面積、色譜峰積分面積與濃度之間的線性關系以及相關系數，并以濃度(mg/mL)為橫坐標、積分面積為縱坐標，應用Origin Pro 8.0軟件，繪制標準曲線。

4)準確度:在規(guī)定范圍內，制備低、中、高3種不同濃度(0.005、0.04、0.1 mg/mL)的 NV 溶液，各測定 3次，即測定 9次，報告已知加入量的回收率(%)。

5)精密度:指在規(guī)定的測試條件下，用同一均質供試品，經多次取樣進行一系列檢測，所得結果之間的接近程度(離散程度)。制備低、中、高3個不同濃度(0.005、0.04、0.1 mg/mL)的 NV 溶液，分別測定3次，考察其精密度。

1.2.3.2 包封率與載藥量的測定

精密稱取適量微球溶于二氯甲烷中，用一定體積(V)去離子水提取鹽酸去甲萬古霉素，采用HPLC法檢測，得到溶液中的鹽酸去甲萬古霉素濃度(C)。計算載藥量和包封率公式為:載藥量=［CV/W0］×100%，包封率 =［CV/W1］×100%。式中，W1為加入NV的藥物量，W0為微球的總重量。將結果帶入上式，分別得到包封率和載藥量。

1.2.4 NV-PLGA-MP-PP的制備

將空白補片剪成1 cm×1 cm的正方形，置于10%EVA的環(huán)己烷溶液中充分浸潤，精密稱量NVPLGA-MP 50 mg，將載藥微球均勻分散在補片上，放置晾干，得到NV-PLGA-MP-PP。

1.2.5 NV-PLGA-MP-PP的形態(tài)觀察

將載藥補片與空白補片對比，分別觀察其表面形態(tài)，用游標卡尺測量其厚度。將NV-PLGA-MP-PP浸于20 mL的PBS中，至于恒溫振蕩器(37℃)，15 d后取出，掃描電鏡觀察微球與補片的結合程度。

1.2.6 NV-PLGA-MP與NV-PLGA-MP-PP的DSC表征

稱取樣品10～20 mg，盛于鋁質坩堝中，密封壓緊后，用氮氣為氛 (靜態(tài))，空鋁盒為參比，控制升溫速率為10℃/min，升溫范圍為30～200℃，掃描速度為 10℃ /min。

1.2.7 NV-PLGA-MP與 NV-PLGA-MP-PP的體外釋放

1.2.7.1 NV-PLGA-MP的體外釋放

取適量的載藥微球凍干粉，均勻分散于5 mL的磷酸緩沖鹽溶液(PBS，pH7.4)中，置于透析袋內，將透析袋放入裝有15 mL PBS的離心管，加蓋。將離心管放入37℃的恒溫振蕩器中，100 r/min，按照一定的時間間隔取樣1 mL溶液，然后每次及時補充同體積新鮮的PBS溶液。取出液注入 HPLC檢測，每份樣品進3針，記錄色譜圖，測定峰面積，計算藥物累積釋放百分率，繪制釋放曲線。

1.2.7.2 NV-PLGA-MP-PP的體外釋放

每1 cm×1 cm正方形的載藥補片上載有一定量微球，釋放及檢測方法同微球的體外釋放。

2 結果

2.1 微球形態(tài)及粒徑分布

通過復乳溶劑揮發(fā)法制備 NV-PLGA-MP，形態(tài)完整，表面平滑，如圖1所示。其中，64%微球粒徑分布在60 ～100 μm，12% 微球粒徑大于 100 μm，24%微球粒徑小于60 μm，由此可見，粒徑分布較均一。

2.2 HPLC方法學

2.2.1 特異性

圖1 NV-PLGA-MP的掃描電鏡圖和粒徑分布。(a)SEM;(b)粒徑分布Fig.1 SEM and size distribution of NV-PLGAMP.(a)SEM;(b)size distribution

根據本研究文中1.2.3.1項下的色譜條件，并按照相應的方法，得NV標準品色譜圖(見圖2(a))和NV-PLGA-MP中NV色譜圖(見圖2(b))。結果表明，載藥微球處理方法不影響NV的測定。該方法適用于微球中NV的檢測。

2.2.2 線性與標準曲線

依據本研究文中1.2.3.1項下色譜條件，按照其中的方法3)，待測物峰面積值為縱坐標，藥物濃度為橫坐標，用加權(W=1/x2)最小二乘法進行回歸運算，得回歸方程 Y=2E+06X－3 625.6，R2=0.999 1，表明鹽酸去甲萬古霉素濃度在0.005～0.1 mg/mL范圍內呈良好的線性關系(見圖3)，符合《化學藥物質量控制分析方法驗證技術指導原則》中關于線性的要求。

2.2.3 準確度與精密度

準確度指用該方法測定的結果與真實值(或認可的參考值)之間接近的程度，應在規(guī)定的范圍內建立，一般以回收率試驗進行驗證，制備3個不同濃度的樣品，各測定3次，報告已知加入量的回收率(%)。

圖2 NV HPLC色譜圖，保留時間分別為4.8 min和4.9 min，色譜條件:柱子為 Kromasil，C18(200 ×4.6 mm，5 μm，十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑);流動相:0.132%磷酸氫二銨水溶液(磷酸調節(jié)pH值至6.0)－甲醇 (74∶26)，流速:1 mL/min，檢測波長:254 nm，進樣量:20 μL。(a)NV對照品 ;(b)NV-PLGA-MPFig.2 Chromatograms of norvancomycin，retention time of each was 4.8 min and 4.9 min，chromatographic conditions:column:Kromasil C18(200×4.6 mm，5 μm);mobilephase:0.132% aqueoussolution of diammonium hydrogen phosphate(PH 6.0)-methanol(74∶26)，rate:1mL/min，detection wavelength:254 nm，sample size:20 μL.(a)reference substance;(b)NV-PLGA-MP

圖3 HPLC-UV法測定鹽酸去甲萬古霉素的典型工作曲線Fig.3 Standard curveofnorvancomycin analyzed by HPLC

精密度指在規(guī)定的測試條件下，同一均質樣品經多次取樣，進行一系列檢測所得結果之間的接近程度，常用標準偏差(standard deviation，SD)和相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)表示。在本實驗中，依據《化學藥物質量控制分析方法驗證技術指導原則》中關于準確度與精密度的要求進行分析，準確度的數據見表1，精密度的數據見表2。

表1 鹽酸去甲萬古霉素HPLC-UV測定方法的準確度Tab.1 Accuracy of norvancomycin HPLC-UV method

表2 鹽酸去甲萬古霉素HPLC-UV測定方法的精密度Tab.2 Precision of norvancomycin HPLC-UV method

2.3 微球的載藥量和包封率

將結果帶入載藥量和包封率公式計算，載藥量結果為19.79%;包封率結果為90.07%。

2.3 NV-PLGA-MP-PP的表面形態(tài)

肉眼觀察，NV-PLGA-MP-PP表面均勻(見圖4(a))，掃描電鏡顯示微球與補片均無損壞(見圖4(b)，4(c))。游標卡尺測量載藥補片厚度為0.82 mm，空白補片厚度為0.35 mm，因此載藥補片上載有NV-PLGA-MP厚度為0.47 mm。在藥物釋放過期間，經搖床持續(xù)振蕩，15 d后觀察 NV-PLGA-MPPP表面形貌(見圖5)，觀察到補片上仍負載有大量微球，表明載藥微球與補片結合得較為牢固。

2.4 NV-PLGA-MP與NV-PLGA-MP-PP的DSC表征

圖4 補片的外觀(a)載藥補片(左)與空白補片(右);(b)NV-PLGA-MP-PP的掃描電鏡圖;(c)PP的掃描電鏡圖Fig.4 Photographs of meshes.(a)Hernia mesh containing norvancomycin-loaded microspheres(NV-PLGA-MP-PP)(left)andblankmesh(right);(b)SEM of NV-PLGA-MP-PP;(c)SEM of PP

DSC圖譜(圖6a)顯示，NV在100℃有較寬的吸熱峰，NV-PLGA-MP在80℃存在吸熱峰，但是溫度較前者左移，而PLGA在80～100℃范圍沒有吸收峰，表明NV-PLGA-MP中包裹有NV藥物，且可能的混合導致其熔融溫度較單純NV樣品低。同樣研究載藥補片與空白補片的熱效應顯示(見圖6(b))載藥補片與空白補片在170℃有吸熱峰，表明載藥補片中載藥微球固載到補片上沒有破壞補片的化學結構;載藥補片與NV-PLGA-MP在80℃存在較寬的吸熱峰，表明載藥補片中的載藥微球結構沒有被破壞。綜合兩者的結果，表明NV-PLGA-MP負載于PP補片屬于物理吸附行為。

圖5 NV-PLGA-MP-PP于 PBS中 37℃ 振蕩浸泡15 d后的SEM圖。(a)40×;(b)700×Fig.5 SEM of NV-PLGA-MP-PP soaked in PBS 37℃in 15 d.(a)40×;(b)700×

2.5 NV-PLGA-MP與NV-PLGA-MP-PP的體外釋放

圖6 示差掃描量熱曲線。(a)不同材料;(b)補片Fig.6 DSC curves.(a)different materials;(b)PP

按照本研究文中2.6的方法，分別考察 NVPLGA-MP和NV-PLGA-MP-PP體外釋放規(guī)律。NVPLGA-MP體外釋放30 min，僅釋放4.48%;釋放20 h，累計釋放量約 70%，4 d后累計釋放率達到92.3%，見圖7(a)。相比之下，NV-PLGA-MP-PP中NV釋放5.4%，需持續(xù)釋放4.08 h;累計釋放率達到72.6%，需28 d，見圖7(b)。因此，NV-PLGA-MP和NV-PLGA-MP-PP的釋放均無突釋現象。

用零級釋放方程、一級釋放方程、Higuchi方程、Weibull方程，分別擬合 NV-PLGA-MP和 NV-PLGAMP-PP的釋放曲線，方程中 t為時間、Q為釋藥率，如表3所示。結果表明，NV-PLGA-MP的釋放符合Weibull方程，對NV-PLGA-MP-PP釋放進行擬合，發(fā)現其與幾種釋放模型均有較好的關聯，相比之下，NV-PLGA-MP-PP更符合零級動力學方程。

表3 NV-PLGA-MP與NV-PLGA-MP-PP體外釋放擬合結果Tab.3 Fit result of NV-PLGA-MP and NV-PLGA-MP-PP

圖7 樣品在PBS緩沖液中的體外釋放曲線。(a)NV-PLGA-MP;(b)NV-PLGA-MP-PPFig.7 Release curve of samples in PBS.(a)NV-PLGA-MP;(b)NV-PLGA-MP-PP

3 討論和結論

采用 HPLC法，檢測 NV-PLGA-MP與 NVPLGA-MP-PP中 NV的含量，對照品與載藥微球經萃取處理后，NV保留時間分別為4.7、4.8 min，出現0.1 min的峰波漂移，在誤差允許范圍內，從而可認為NV保留時間不受操作萃取分離的影響，檢測NV-PLGA-MP與 NV-PLGA-MP-PP中NV含量均可采取萃取處理，得到萃取溶液進HPLC儀檢測。此外，該方法的精密度與準確度結果進一步驗證了方法的靈敏度與可靠性。

由于本實驗采用的模型藥－鹽酸去甲萬古霉素具有極好的水溶性，支撐劑EVA只在有機溶劑中溶解，從而導致NV不能均勻地分散在補片上，因此不能將藥物直接加到補片中。在本研究的NVPLGA-MP-PP制備方法中，將 NV-PLGA-MP通過EVA作為支撐劑固載至聚丙烯材料表面，制得的攜藥補片NV-PLGA-MP-PP表面平整、厚度均一，肉眼和顯微鏡觀察補片結構沒有損壞，并且微球與補片結合牢固。通過量熱分析藥物和釋放研究，均表明該種負載屬于物理負載，沒有改變相關成分的化學結構，因而總體結果會是性能的疊加，即具有緩釋抗菌的攜藥補片。載藥量決定載藥移植物的抗菌活性，也影響其釋藥的持續(xù)時間。應用本方法制備的微球載藥量高，從而固載于補片上的藥物量較高。

本研究模擬生理條件，將載藥補片材料放入PBS中置搖床振蕩，定時吸取釋放液，采用HPLC法測定載藥補片的藥物釋放量。結果表明，NV-PLGAMP-PP釋藥時間超過28 d，提示其緩釋性能良好，沒有突釋現象。

對NV-PLGA-MP與NV-PLGA-MP-PP進行體外釋放模型模擬，發(fā)現 NV-PLGA-MP的釋放符合Weibull方程，其次符合 Higuchi方程，而 Weibull方程對大多數基質的釋放均有很好的擬合［19］。因此，NV-PLGA-MP對Higuchi方程的擬合結果對考察微球釋放有一定的指導意義。Higuchi方程是模擬擴散釋放機制主導的釋放過程，對包載水溶性藥物有很好的擬合［19］;NV是水溶性藥物，控制包載有 NV微球釋放的主要因素是NV的擴散速度。所以在本研究中，與水充分接觸的NV-PLGA-MP釋放較快。

對NV-PLGA-MP-PP釋放進行擬合發(fā)現，其與幾種釋放模型均有較好的關聯，表明該體系的釋放不是一個單獨的釋放過程，是多個釋放方程的組合，是一個復雜的、多種釋放累加的釋放過程?？赡苁怯捎贜V-PLGA-MP嵌入補片材料的深度差異，表層微球的釋放相對較快，而深處嵌入的微球釋放緩慢，每一個檢測時間點均是由表層與深層的釋放組合，這種組合并非完全均一，因而總體顯得不太規(guī)則。NV-PLGA-MP-PP中添加了 EVA，EVA膜能夠阻止藥物的遷移滲透［20］，并且載藥補片只有部分附在表面的微球直接與水分子接觸，藥物從基質中自身的溶蝕速度對釋放也有一定的影響，所以NVPLGA-MP-PP釋放時間較長。因此，NV-PLGA-MP與NV-PLGA-MP-PP兩種載藥方式的可持續(xù)釋放時間有較大差別。

4種基本釋放模型相比之下，NV-PLGA-MP-PP更符合零級動力學方程。經皮給藥系統、涂層基質、膜控釋基質等藥物釋放過程基本依照零級動力學方程［19］，本實驗的結果與膜負載藥物控釋機制相符，據此推斷 NV-PLGA-MP-PP可以通過黏膜滲透治療疝修補術周圍病灶的感染。

綜上所述，所制備的 NV-PLGA-MP-PP具有良好的形態(tài)和持久的藥物緩釋性能，可成為理想的抗感染疝補片材料，其具體抗菌效果正在進行系統研究。

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