射頻毀損灶體積與近紅外光學參數(shù)的相關性研究

邢麗冬 錢志余 陶振玉 楊天明

1(南京航空航天大學自動化學院，南京 210016)

2(東南大學醫(yī)學院，南京 210009)

引言

目前，射頻熱凝毀損術在現(xiàn)代功能及立體定向神經(jīng)外科領域已得到廣泛應用，在帕金森病(Parkinson disease，PD)治療中，毀損術有效率為90% ～93.5% ，而且療效較為肯定持久［1－3］。國內(nèi)外功能神經(jīng)外科對射頻熱凝毀損術的研究差異較大，結論不一。而多數(shù)學者認為作用組織環(huán)境對毀損體積有較大影響［4－5］，通過控制毀損溫度和時間來確定毀損灶的范圍是有效的［6－7］，有文獻做過仿真研究［8］，但具體的量化關系還未見報道。

近紅外光譜(near infrared spectroscopy，NIRS)技術是近年發(fā)展起來的一種檢測組織結構性質和動態(tài)功能的方法，能實時在位測量腦組織的光學系數(shù)，用于臨床診斷中具有很多優(yōu)勢［9－11］。有研究表明，大鼠腦組織的優(yōu)化散射系數(shù)(scattering coefficient，μs')在腦白質與灰質中有顯著差別，μs'既是組織結構的固有光學特征，又能反映與神經(jīng)元活動相關的變化，且受組織內(nèi)血流量、血紅蛋白及水含量等影響小，更宜作為組織定位時的特征參數(shù)［12－14］。

本研究通過建立大量射頻熱凝毀損灶模型，包括體內(nèi)模型和體外模型，控制不同的毀損溫度、時間，測量模型毀損體積，通過統(tǒng)計分析，建立毀損體積與時間、溫度的數(shù)學模型，同時使用近紅外光譜微探頭，觀察記錄毀損過程中的光學參數(shù) μs’變化情況，探討 μs’與射頻毀損灶體積的相關性，為NIRS在對射頻毀損手術實時監(jiān)控中的應用提供參考。

1 實驗

1.1 體外蛋清射頻毀損灶模型體積的獲取實驗

1.1.1 實驗條件

本研究所用到的儀器主要包括:Radionics射頻儀(ASA-601T，深圳安科高技術股份有限公司，深圳)及射頻針(針頭外徑 1.1 mm，裸露長度 2.0 mm)，燒杯、鐵架臺、溫度計、游標卡尺、恒溫水浴箱(HH.W 21.600，上?？莆鲈囼瀮x器廠，上海)。

新鮮雞蛋:(50±5)g。

體外實驗分為 32 組，預置溫度 45、60、65、70、75、80、85、90℃ ，每一溫度分別持續(xù) 30、60、90、120 s制造毀損灶體積模型，每組建立體積模型100個(45℃、120 s時未見毀損灶形成，故各組只選取10例)。

1.1.2 實驗步驟

步驟1:將新鮮雞蛋打破，將蛋清盛于燒杯中，杯口與液面距離約2 cm。

步驟2:固定鐵架臺，射頻電極(正極)上端固定于鐵架臺，電極頭浸沒于蛋清中約2.0 cm。

步驟3:調(diào)節(jié)恒溫水箱溫度至37℃，將射頻電極(負極)置于燒杯底部，將盛有蛋清燒杯置于恒溫37℃水浴箱中。

步驟4:將溫度計置于蛋清溶液中，直至蛋清溶液溫度達到37℃。

步驟5:將要設置的毀損溫度時間在射頻儀上設定后，開啟射頻儀進行毀損實驗。

步驟6:游標卡尺測出蛋清凝固最大直徑(D)和高(H)，經(jīng)橢球形體積公式πD2H 計算體積(其中:D=2R，H=2h)。

1.2 體內(nèi)大鼠腦射頻毀損灶模型體積的獲取及NIRS監(jiān)測實驗

1.2.1 實驗條件

儀器:Radionics射頻儀及射頻針(針頭外徑1.1 mm，裸露長度2.0 mm)、江灣Ⅰ型立體定向儀、步進電機驅動器及控制器、計算機和相關軟件、手術器械。

材料:生理鹽水、1%戊巴比妥鈉溶液、4%多聚甲醛溶液。

動物:SD成年大鼠(由東南大學實驗動物中心提供)220～300 g，雌雄不拘。

1.2.2 術前準備

1)SD成年大鼠192只，隨機分組，每組6只，每只大鼠建立一個體內(nèi)毀損灶體積模型。

2)術前12 h禁食，不禁水，麻醉前30 min予以阿托品0.05 mg肌注，以抑制手術過程中呼吸道分泌，保持呼吸道通暢。

3)準備好手術室、手術臺、無影燈、手術器械等常規(guī)設備，空調(diào)控制在25℃，實驗室遮擋強光處理(如陽光等變化光源);調(diào)試 NIRS系統(tǒng)軟件、對NIRS系統(tǒng)進行定標。

4)1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，平均5～10 min麻醉達到理想效果。疼痛刺激大鼠尾部，大鼠無明顯肢體反應。

1.2.3 實驗步驟

步驟1:對大鼠頭皮手術區(qū)進行備皮。

步驟2:水平立體定向儀。上耳桿，將兩耳桿插入大鼠外耳道內(nèi)，手法正確時可聽到明顯鼓膜刺破的“咔嗒”聲;門齒嵌入門齒鉤至齒根部，壓緊。此時大鼠前、后囟點位于同一水平面內(nèi)，大鼠頭顱固定牢固無松動。

步驟3:碘伏消毒，鋪洞巾，沿顱頂中線剪開頭皮1.5～2.0 cm，常規(guī)壓迫止血，向兩側分離軟組織直至充分暴露顱骨。

步驟4:切開頭皮約1.5～2.0 cm，剝離骨膜，參照Paxinos等所著大鼠腦立體定向圖譜，Vim坐標為:前囟向后2.5 mm，矢狀縫旁開1.4 mm，硬腦膜下6.4 mm。牙科鉆小心鉆透顱骨。

步驟5:按確定坐標將毀損電極與經(jīng)過定標的近紅外探頭(本實驗使用特制的內(nèi)置四光纖探頭(三根半徑0.2 mm與一根半徑0.6 mm單模光纖前端融合進一內(nèi)徑1.2 mm鋼管，分別作為傳輸和接收光纖)一同緩慢步進至預定深度。開啟近紅外光源，記錄毀損前靶點優(yōu)化散射系數(shù)μs'的變化，5 min后開啟射頻儀進行毀損實驗。

步驟6:毀損結束后近紅外探頭監(jiān)測 μs'變化，10 min后緩慢退出電極與探頭，牙科膠覆蓋鉆孔，骨蠟封閉骨孔，常規(guī)縫合傷口。

步驟7:手術后，大鼠單籠放置，側臥位。待大鼠完全清醒后，再合籠飼養(yǎng)。防止早期蘇醒大鼠攻擊同類。

步驟8:術后連續(xù)每天腹腔注射青霉素5萬U以防治感染。予以充足的鼠糧及水，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 醫(yī)學檢測

1.3.1 影像學檢查

1)大鼠射頻毀損術后72 h，進行7.0 T微 MRI檢查(PharmScan 7.0T，BRUKER公司，德國)。

2)MRI檢查前12 h禁食，不禁水，麻醉前30 min予以阿托品0.05 mg肌注，以抑制掃描過程中的呼吸道分泌，保持呼吸道通暢。

3)1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，平均5～10 min麻醉達到理想效果。此時，疼痛刺激大鼠尾部，大鼠無明顯肢體反應。

4)將大鼠放進MRI機檢查臺中進行掃描。軸位 SE序列 T2WI:TR 5400 ms，TE 20 ms，層厚 1.0 mm，間隔 0 mm，視野(FOV)3.5 cm，矩陣 256×256。

5)實驗后，大鼠斷頭取腦行病理學監(jiān)測。

1.3.2 病理學監(jiān)測

大鼠行MRI掃描后，進行光鏡觀察，根據(jù)影像學資料，以針道為中心，分別取毀損灶中心液化壞死區(qū)、反應區(qū)、水腫帶內(nèi)腦組織各一塊以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，冠狀切片，厚約5 μm，常規(guī) HE染色，光鏡下觀察并攝片。

腦組織各一塊投入預冷的2.5%戊二醛固定，常規(guī)丙酮梯度脫水，Epon812包埋、半薄切片、定位、修塊。LKB-4型超薄切片機切片，厚度40～50 nm。室溫下進行鉛-鈾染色。JEM-100CXⅡ型透射電鏡觀察、攝片。

2 實驗結果

2.1 體外實驗結果

在體外實驗中，單極裸露尖端在溫度逐漸升高時逐漸形成橢球形蛋清凝塊，45℃無肉眼可見蛋白凝固形成，60℃形成較規(guī)則可測量橢球形蛋清凝塊。毀損溫度達到80℃時可見少量蛋清凝塊粘連，85～90℃出現(xiàn)明顯粘連、碳化。具體不同毀損溫度和時間測得的毀損灶直徑、高及計算的體積見表1。

2.2 體內(nèi)實驗結果

體內(nèi)實驗具體不同毀損溫度和時間測得的體大鼠腦毀損灶體積毀損灶直徑、高、計算的體積及測得的優(yōu)化散射系數(shù)μs'見表1，考慮到大鼠的個體差異，定義大鼠優(yōu)化散射系數(shù)相對變化值Rμs'為每個μs'射頻過程中的峰值與該大鼠射頻手術前初始狀態(tài)的均值的差值，表1中示出。

2.3 影像學檢查結果

體內(nèi)試驗毀損溫度45℃組未見明顯毀損灶形成，MRI掃描僅見穿刺針道，證明實驗45℃作為可逆性破壞安全可行的結論是正確的。圖1示出了部分MRI檢查掃描圖片，圖1(a)為毀損溫度75℃毀損時間120 s時針道中心層面軸位MRI掃描圖片，圖1(b)為毀損溫度85℃毀損時間120 s時針道層面軸位MRI掃描圖片，圖中箭頭所指為毀損灶區(qū)域。MRI掃描可觀察到，毀損溫度60℃組至90℃組各組均形成較典型的“靶征”或“同心圓征”，表現(xiàn)為中心長T2高信號點，中間為短 T2低信號環(huán)，最外為長T2高信號環(huán)。毀損溫度達到80℃時可見少量腦組織粘連，85～90℃出現(xiàn)明顯粘連、碳化。毀損灶中心的部分缺損為腦組織粘連射頻針造成。

2.4 光鏡檢查結果

圖2示出了部分光鏡下的攝片，圖2(a)為毀損灶中心，可觀察到神經(jīng)細胞明顯減少，出現(xiàn)液化壞死;圖2(b)為毀損灶反應帶，可觀察到神經(jīng)細胞減少，周圍出現(xiàn)水腫;圖2(c)為毀損灶水腫帶，可觀察到組織間隙明顯增大，血管周水腫明顯;圖2(d)為45℃針道中心腦組織。光鏡檢查結果顯示毀損溫度45℃組，即使毀損時間達到120s亦未見明顯神經(jīng)細胞的變性壞死。毀損溫度從60℃起始至90℃各組毀損灶病理變化大致相同，毀損灶內(nèi)層為液化性壞死，神經(jīng)細胞完全變性壞死，細胞結構完全消失，神經(jīng)細胞明顯減少，可見少量神經(jīng)細胞腫脹，反應帶主要為腫脹神經(jīng)細胞，喪失經(jīng)典的多極形狀而變?yōu)閳A形，胞核偏位、濃縮、濃染，Nissl小體崩解為細塵狀顆粒，最外層為水腫帶，部分神經(jīng)細胞腫脹變形，并可見少量血管擴張、充血、炎細胞浸潤。

表1 不同毀損溫度時間下的體內(nèi)外毀損灶模型的測量值Tab.1 The measurements of in vivo and in vitro lesion damage models under different temperature-time

2.5 電鏡檢查結果

圖3為部分電鏡攝片，圖3(a)箭頭所指為神經(jīng)元，圖3(b)箭頭所指為小膠質細胞，圖3(c)箭頭所指為神經(jīng)細胞，圖3(d)箭頭所指為血管。透射電鏡可觀察到射頻毀損灶中心及反應帶神經(jīng)細胞胞質內(nèi)細胞器明顯減少，染色質電子密度降低，神經(jīng)元細胞核周間隙增寬，小膠質細胞向神經(jīng)細胞靠近，有吞噬受損神經(jīng)細胞傾向，水腫帶主要見血管管周水腫，內(nèi)皮細胞增生，神經(jīng)細胞變性壞死未發(fā)現(xiàn)。

圖1 射頻毀損術后MRI檢查圖片。(a)75℃、120 s針道中心層面軸位;(b)85℃、120 s針道層面軸位Fig.1 The images of MRI examination after radiofrequency ablation.(a)75℃120 s the dimension of needle central in axial scans;(b)85℃120 s the dimension of needle level in axial scans

圖2 光鏡下攝片(HE，200×)。(a)毀損灶中心;(b)毀損灶反應帶;(c)毀損灶水腫帶;(d)45℃針道中心腦組織Fig.2 Photographs under light microscope(HE，200×).(a)damage foci center;(b)damage response foci;(c)damage foci edema(d)45℃needle central brain

圖3 電鏡下攝片。(a)神經(jīng)元;(b)小膠質細胞;(c)神經(jīng)細胞;(d)血管Fig.3 Electron microscope photographs.(a)neurons;(b)microglia;(c)nerve cells;(d)vein

3 分析與討論

表1實驗數(shù)據(jù)表明:相同的毀損溫度和毀損時間下，體外蛋清毀損灶體積比體內(nèi)大鼠腦毀損灶體積要大，大概為1.4倍。原因分析為射頻的透射深度與組織的含水量成反比，蛋清含水量比腦組織的豐富，射頻輻射的穿透性低，于局部產(chǎn)生的熱效應比腦組織強，產(chǎn)生的毀損體積較大。另外，體內(nèi)外毀損灶形狀亦存在差異，體外實驗所得直徑大于高(75℃、120 s組除外)，而體內(nèi)試驗所得直徑小于高，這種體內(nèi)外毀損灶形狀的差異是因體內(nèi)針道損傷合并熱毀損效應引起。在體外蛋清毀損實驗中，45℃組毀損時間達到120 s亦未觀察到肉眼可見蛋清凝塊，據(jù)此，45℃作為可逆性破壞安全可行。

表1實驗數(shù)據(jù)看出:體內(nèi)外實驗中，相同毀損溫度下，隨著毀損時間的延長，毀損灶體積逐漸增大，每間隔30 s，毀損體積即有顯著性差異;相同毀損時間下，隨著毀損溫度的升高，毀損灶體積逐漸增大，每間隔5℃體積即有顯著性差異。實驗中各毀損溫度下毀損時間在30～120 s這一段毀損灶體積均呈增大趨勢，與文獻［15］報道“溫度達到某個臨界點時(75℃或以上)毀損灶體積不會隨溫度升高而增大”不同。從內(nèi)外毀損體積數(shù)據(jù)可看出隨著時間、溫度的變化，體內(nèi)外毀損灶體積有相似的變化趨勢。進一步通過數(shù)據(jù)擬合探索體內(nèi)外毀損體積與毀損時間、毀損溫度之間的量化關系，建立它們之間的數(shù)學關系模型，尋得一般性規(guī)律。

利用1stOpt的自動搜索擬合功能，選取麥夸特法(Levenberg-Marquardt)和通用全局優(yōu)化法得到相關系數(shù)(R)較高的關系式，為了便于比較，選取冪級數(shù)關系式

式中，V表示毀損體積，T表示毀損溫度，t表示毀損時間。

體外模型:p1= －0.054，p2= 1.95，p3= －0.226，p4=5.7 ×10－3，p5= － 6.015 ×10－5，p6=2.466 × 10－7，p7= 1.877，p8= －0.022 8，p9=1.048 9 ×10－4，計算的相關系數(shù)(R):0.929。

體內(nèi)模型:p1= －4.61×104，p2=3.201×103，p3= －88.598，p4=1.221，p5= － 8.37 ×10－3，p6=2.289 ×10－5，p7=1.192，p8= －0.014，p9=6.433×10－5。計算的相關系數(shù)(R):0.922。

對比式(1)各系數(shù)在體內(nèi)外模型中的具體值可看出對應系數(shù)的正負號完全相同，如 p1、p3、p5、p8都為正，其它都為負，證明兩種關系式的變化趨勢是相同的;式(1)中與 T關聯(lián)的項有5項最高階為5階，與t關聯(lián)的項有3項，最高階為3階，說明毀損體積相對于時間受溫度的影響更大。

對體內(nèi)毀損體積與溫度-時間關系進一步深度擬合，得到17種算法的計算結果相關系數(shù) R＞0.95，為便于實際應用，選擇一種系數(shù)少的關系式(2):

式中，p1=1.331 ×10－11，p2=5.702，p3=0.825，計算相關系數(shù)(R):0.9867，相關系數(shù)之平方(R2):0.9735。

式(2)能較好的反映毀損溫度、時間對毀損灶體積的聯(lián)合效應的影響。臨床時可根據(jù)需要毀損核團的大小制定合適的毀損體積，利用式(2)表示的體內(nèi)毀損灶模型，參考各溫度時間下的毀損直徑、高，選擇最合適的毀損溫度與時間，也可以1.4倍體內(nèi)毀損核團的大小制定毀損體積，在體外蛋清毀損中得到合適的射頻溫度和時間。這一研究結果對提高毀損療效有一定的指導意義。實驗在80℃時即出現(xiàn)粘連現(xiàn)象，60℃即可形成永久性毀損，故常用毀損溫度推薦60～75℃，本實驗支持以往結論［5，9，15］。

理論上，在腦組織的幾何結構、成分和探查距離不變的情況下，對同一波長的近紅外光的吸收是恒定的，射頻毀損作用使腦組織變性壞死，導致腦組織的相關光學參數(shù)發(fā)生變化，μs'亦發(fā)生相應的變化。有實驗表明當溫度達到臨界毀損溫度以上時，μs'出現(xiàn)明顯上升，而射頻結束后μs'保持在峰值水平無下降，明確地反映了腦組織病理變化情況［7，9－10］。表 1 實驗數(shù)據(jù)表明，射頻毀損期間，當射頻溫度不變，隨著射頻時間的延長，μs'有相應升高的趨勢，當射頻時間不變，隨著射頻溫度的升高，μs'也有相應升高趨勢;Rμs'出現(xiàn)了與 μs’相同的變化趨勢。結合相應毀損溫度時間下的毀損體積變化規(guī)律，提示 μs'可反映腦組織被毀損程度，且 μs'上升幅度越大，說明組織變性的程度越高越徹底。

應用同樣方法建立 μs'、Rμs'與溫度 T、時間 t之間的數(shù)學關系模型為式(3):

式(3)形式與式(2)相同，其中 p1=1 335.8，p2= －82.087，p3= 2.003 1，p4= －0.023 95，p5=1.401 2 × 10－4，p6= －3.200 0 × 10－7，p7=0.056 2，p8= －5.849 2 ×10－4，p9=2.539 7 ×10－6，計算的相關系數(shù)(R):0.991。

Rμs'也有相同的關系式，其中 p1=1 678.7，p2= －105.89，p3= 2.634 7，p4= －0.032 3，p5=1.946 4 × 10－4，p6= －4.620 0 × 10－7，p7=0.047 1，p8= －4.414 3 × 10－4，p9= 1.881 8 ×10－6，計算的相關系數(shù)(R):0.992。

將相同毀損溫度和時間下的毀損體積與 μs'及Rμs'建立關系如公式(4):

式中，p1=22.747，p2= － 60.277，p3=184.72，。計算的相關系數(shù)(R):0.973。

Rμs'也有相同的關系式，其中 p1=8.829 1，p2= －60.248，p3=184.41，計 算 的 相 關 系 數(shù)(R):0.974。

實驗結果表明 μs'、Rμs'能夠較好地反映腦組織的變性程度，進而能較好地實時反映腦組織射頻毀損灶體積的變化情況，式(4)反映了它們的相關性，這一結果為實施近紅外實時監(jiān)測的可行性提供了實驗依據(jù)。

4 結論

進行了不同毀損溫度和時間下的蛋清射頻毀損灶模型和活體內(nèi)大鼠腦射頻毀損灶模型實驗，實驗后對大鼠的病理學檢測證明實驗是有效的。通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計得到了毀損灶體積隨毀損溫度和時間變化的一般性規(guī)律，通過數(shù)據(jù)擬合得到了相關系數(shù)(R為0.986 7)較高的數(shù)學模型。在手術精確定位前提下，根據(jù)目標核團的大小制定合適的預毀損體積，從而選擇相應的溫度和時間，達到提高毀損術效果。

通過對靶點處的生物組織光學參數(shù)優(yōu)化散射系數(shù)μs’及Rμs’的測定，證明其與射頻毀損灶體積有很好的相關性，可反映毀損體積的變化情況，可作為腦深部神經(jīng)核團射頻毀損術實時監(jiān)測的指標。建立了優(yōu)化散射系數(shù)與毀損體積之間的關系(相關系數(shù)R為0.973)，為探索近紅外光譜技術在帕金森病射頻毀損手術實時監(jiān)控中的可行性提供了實驗依據(jù)。

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