“瘦肉精”檢測卡（試紙條）質(zhì)量驗證試驗

盧明艷 何雷堂 馬瑞林 鄭麗敏 劉海琴

“瘦肉精”檢測卡（試紙條）（目前主要指鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇三種試紙條）由于具有靈敏度高（3～5 μg/kg）、檢測時間短（3～5 min）、準確度高、易貯存（保存溫度4～30℃）、攜帶方便、可進行現(xiàn)場操作等特點，而成為豬尿中違禁藥物篩查時的首選產(chǎn)品，廣泛地應用于生豬產(chǎn)地檢疫環(huán)節(jié)、運輸環(huán)節(jié)、屠宰環(huán)節(jié)。使用“瘦肉精”檢測卡（試紙條）對豬尿中違禁藥物進行初步篩查，已成為法定檢測程序。

當前，國內(nèi)生產(chǎn)“瘦肉精”檢測卡（試紙條）的廠家眾多，試劑條的質(zhì)量參差不齊，同一廠家不同批次的產(chǎn)品質(zhì)量差異很大，致使現(xiàn)場檢測過程中，要么假陽性樣品數(shù)量太多，增加了監(jiān)管部門確認經(jīng)費的負擔，要么出現(xiàn)假陰性樣品，導致獸藥殘留超標的畜產(chǎn)品流入市場，造成畜產(chǎn)品質(zhì)量安全隱患。

因此，“瘦肉精”檢測卡（試紙條）在使用前進行質(zhì)量驗證是確保試紙條檢測結(jié)果準確有效的重要手段，必不可少。筆者在實際工作中對6個廠家的12批次產(chǎn)品進行了質(zhì)量驗證，現(xiàn)將驗證方法及體會寫下來，供同行商榷。

1 驗證參數(shù)及判定標準

1.1 檢測閾值

即試劑條能檢測出來的最低濃度值。當檢測閾值等于試紙條標示的檢測限時，該試紙條為合格。當其小于或大于檢測限時，會導致高的假陽性率或高的假陰性率，此試紙條判為不合格。

1.2 假陰性率和假陽性率

國內(nèi)外對于快速檢測技術(shù)的一個基本原則是“絕不能有假陰性，但允許有假陽性”。按照農(nóng)業(yè)部獸藥殘專家委員會評審快速檢測卡（試紙條）備案時的有關(guān)要求，快速檢測卡（試紙條）的假陽性率應＜10%。

2 材料

2.1 空白豬尿樣品20頭份，分別編號為A1、A2、A3、……、A20。從鶴壁市某養(yǎng)豬場采集，用液－質(zhì)聯(lián)用儀方法檢測，未檢出鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇。

2.2 鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇標準品，從中國計量科學研究院購買。

2.3 鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇標準儲備液（1 mg/ml）配制方法：準確稱取鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇標準品約10.0 mg，分別置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。貯存于－18℃冰箱中，有效期為1年。

2.4 鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇標準中間工作液（10 μg/ml）配制方法：用微量移液器移取標準儲備液100 μl，置于10 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。貯存于－18℃冰箱中，有效期為1個月。

2.5 微量移液器:0～1000 μl。

2.6 瘦肉精試紙條：鹽酸克倫特羅試紙條（檢測限為3 ng/ml）、萊克多巴胺試紙條（檢測限為2 ng/ml或5ng/ml）、沙丁胺醇試紙條（檢測限為5ng/ml或3ng/ml）。

2.7 陰性豬尿樣品一制備方法：取2.1節(jié)空白豬尿樣品任一頭份（例如：A1）5 ml，置于50 ml塑料瓶中。

2.8 陰性豬尿樣品二制備方法：取2.1節(jié)空白豬尿樣品任一頭份（例如：A1）5 ml，置于50 ml塑料瓶中。再分別移取適量鹽酸克倫特羅的標準中間工作液加入空白豬尿中，配制濃度為鹽酸克倫特羅檢測卡（試紙條）標示的檢測限－1的陰性豬尿樣品（即鹽酸克倫特羅的濃度為2 ng/ml），混勻備用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

用同樣的方法分別制備萊克多巴胺、沙丁胺醇的陰性豬尿樣品（萊克多巴胺的濃度為4 ng/ml或1 ng/ml，沙丁胺醇的濃度為2 ng/ml或4 ng/ml）。

2.9 陽性添加樣品

2.9.1 陽性豬尿樣品一制備方法：取2.1節(jié)空白豬尿樣品任一頭份（例如：A1）5 ml，置于 50 ml塑料瓶中。再移取適量鹽酸克倫特羅標準中間工作液加入空白豬尿中，配制濃度為鹽酸克倫特羅檢測卡（試紙條）標示的檢測限的陽性豬尿樣品（即鹽酸克倫特羅的濃度為3 ng/ml），混勻備用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

用同樣方法，制備萊克多巴胺、沙丁胺醇陽性豬尿樣品一（萊克多巴胺的濃度為5 ng/ml或2 ng/ml，沙丁胺醇的濃度為3 ng/ml或5 ng/ml）。

2.9.2 陽性豬尿樣品二制備方法：取2.1節(jié)空白豬尿樣品任一頭份（例如：A1）5 ml，置于 50 ml塑料瓶中。再移取適量鹽酸克倫特羅標準中間工作液加入空白豬尿中，配制濃度分別為10 ng/ml的鹽酸克倫特羅陽性豬尿樣品混勻備用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

用同樣方法，制備萊克多巴胺、沙丁胺醇陽性豬尿樣品二（萊克多巴胺的濃度為10 ng/ml，沙丁胺醇的濃度為 10 ng/ml）。

3 方法

3.1 試紙條的使用步驟及結(jié)果判讀

將未開封的試紙條恢復至室溫。將試紙條水平放置，用滴管向試紙卡孔緩慢逐漸加入3滴不含氣泡的檢測液（約 80 μl）。反應 3～5 min后判讀結(jié)果。結(jié)果判定：用肉眼觀察，依照說明書進行結(jié)果判定。

3.2 檢測閾值的測定

用鹽酸克倫特羅試紙條分別對陰性豬尿樣品一、陰性豬尿樣品二、陽性豬尿樣品一、陽性豬尿樣品二進行檢測，每個樣品兩個重復，記錄下來呈現(xiàn)陽性的最低濃度值。如果陽性豬尿樣品二也不呈現(xiàn)陽性，則配制濃度更高的陽性豬尿樣品進行檢測，直至出現(xiàn)陽性結(jié)果為止。然后，在出現(xiàn)陽性的最低濃度值和該值前一個濃度值之間配制數(shù)量差為1 ng/ml的系列濃度的陽性豬尿樣品，每個濃度各用2條試紙條進行檢測，出現(xiàn)陽性的最低濃度值即為該試紙條的檢測閾值。

3.3 假陽性率的測定

取空白的豬尿樣品 A1、A2、A3、……、A20各一份，每份量為10 ml，然后，按照陰性豬尿樣品二的制備方法，制備 A1′、A2′、A3′、……、A20′等 20 份陰性豬尿樣品。對 A1、A2、A3、……、A20，A1′、A2′、A3′、……、A20′等40份豬尿樣品用檢測卡檢測，每個樣品做兩個重復，在常溫（20～30℃）條件下，按照說明書，進行結(jié)果判定，統(tǒng)計假陽性數(shù)，按照下面的公式計算假陽性率。

假陽性率(%)=假陽性數(shù)/80×100

3.4 假陰性率的測定

按照陽性豬尿樣品一的制備方法，制備A1″、A2″、A3″、……、A20″等20個陽性豬尿樣品，用檢測卡進行檢測，每個樣品做兩個重復，在常溫（20～30℃）條件下，按照說明書，進行結(jié)果判定，統(tǒng)計假陰性數(shù)，按照下面的公式計算假陰性率。

假陰性率(%)=假陰性數(shù)/40×100

4 結(jié)果與討論

筆者在工作中，對6個廠家12批次的試紙條進行了驗證，現(xiàn)將結(jié)果簡要整理如下。

4.1 驗證參數(shù)

試紙條在使用前，應對三個參數(shù)進行驗證，分別是：檢測閾值、假陰性率、假陽性率(見表1)。

但是，從表1中發(fā)現(xiàn)，檢測閾值高于檢測限的情況較為常見，有的產(chǎn)品檢測閾值甚至達到30 ng/ml，是檢測限的6倍。另外，根據(jù)國家相關(guān)規(guī)定，試紙條用于篩選方法時，假陰性率必須為零。因此筆者認為，如果沒有條件對三個參數(shù)都進行驗證時，應至少對“檢測閾值”、“假陰性率”這兩個參數(shù)進行驗證。

4.2 每批產(chǎn)品是否都要驗證

表1 不同廠家試紙條測定結(jié)果

從表1中可以看出，試紙條產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，差別極大。即使有備案文號的試紙條每批產(chǎn)品的質(zhì)量也有差異，如杭州B公司生產(chǎn)的兩批萊克多巴胺試紙條。因此建議，每批產(chǎn)品使用前，均須進行驗證。

4.3 檢測閾值的問題

筆者認為“檢測閾值”這個參數(shù)應先驗證，根據(jù)它的結(jié)果，再考慮其它參數(shù)是否需要驗證。筆者認為當其高于或低于檢測限時，由于出現(xiàn)高的假陰性率或假陽性率，導致問題畜產(chǎn)品流入市場或增加了監(jiān)管部門確認經(jīng)費的負擔，因此均應判為不合格。只有二者相等時，才進行另外兩個參數(shù)的驗證。

4.4 假陽性率的問題

由于尿液中樣本成分復雜，特別是在含有鹽酸克倫特羅結(jié)構(gòu)相近的代謝物時，都將導致出現(xiàn)假陽性，因此，試紙條出現(xiàn)假陽性是不可避免的。但由于檢測卡主要用于篩選方法，可以允許一定的假陽性率。根據(jù)相關(guān)規(guī)定，假陽性率允許10%以下。

[1]農(nóng)業(yè)部農(nóng)醫(yī)發(fā)[2005]17號文件“關(guān)于發(fā)布《獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑（盒）備案審查技術(shù)資料要求》和《獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑（盒）備案參考評判標準》的通知”.

[2]GB/T22147—2008.飼料中沙丁胺醇、萊克多巴胺和鹽酸克侖特羅的測定.

[3]農(nóng)業(yè)部1025號公告-16-2008動物尿液中鹽酸克倫特羅殘留檢測氣相色譜-質(zhì)譜法.

[4]譚美英.鹽酸克倫特羅快速檢測卡的檢測效果評價[J].湖南飼料，2006(6):38.