千島湖細(xì)鱗鲴種群線粒體COⅠ基因變異及遺傳分化研究

曲憲成，張 勇，劉其根，張開岳，蔣驕云，馮 龍

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于DNA序列測定的分子數(shù)據(jù)已被廣泛應(yīng)用于種群遺傳結(jié)構(gòu)以及系統(tǒng)發(fā)育的研究中。線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）具有分子小、編碼率高、拷貝數(shù)多、進(jìn)化速率快、遵循母系遺傳等特征，使得其在魚類分子進(jìn)化、種群遺傳結(jié)構(gòu)等研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1]。由于其基因組的大小與基因的空間排列相當(dāng)穩(wěn)定，且不同基因進(jìn)化速度不同，因此可以根據(jù)不同物種以及物種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近以及研究的水平選取合適的線粒體基因片段進(jìn)行種群結(jié)構(gòu)分析。其中魚類線粒體細(xì)胞色素氧化酶I亞基（cytochrome oxidase subunit I gene，COⅠ）功能保守，同時(shí)又具有一定進(jìn)化速率，已成為群體結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)發(fā)育等領(lǐng)域應(yīng)用較廣的分子標(biāo)記[2]。

千島湖是人工修建水利大壩后形成的湖泊，湖泊的形成改變了原來的生態(tài)環(huán)境，環(huán)境的改變對魚類種群會(huì)有一定影響[3]。細(xì)鱗鲴（Xenocypris microlepis）在千島湖中分布廣泛，數(shù)量較為龐大的種群。細(xì)鱗鲴隸屬于鯉形目，鯉科，鲴屬。頭小，口下位，體側(cè)扁，呈錐形，體銀白色，背部灰黑色，鱗片細(xì)小，排列緊密。其肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美，食料來源廣泛，飼養(yǎng)容易簡便，深受人們歡迎。在我國大多數(shù)江河湖泊中均有分布，通常生活在江河、水庫、湖泊中下層，以其發(fā)達(dá)的下頜角質(zhì)刮食在水底的藻類和有機(jī)碎屑，具有凈化水質(zhì)的作用[3]。目前，細(xì)鱗鲴群體分析僅有喬德亮[4]利用形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行過探討，還未見用分子遺傳標(biāo)記分析的報(bào)道。本研究采集了千島湖中的地理位置相對較遠(yuǎn)的汾口（FK）、姜家鎮(zhèn)（JJZ）、富文（FW）、臨岐（LQ）4個(gè)地點(diǎn)的細(xì)鱗鲴群體，并利用線粒體COⅠ基因部分序列為標(biāo)記，對這4個(gè)群體進(jìn)行分析，一方面可以了解千島湖細(xì)鱗鲴的種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性，另一方面可以了解環(huán)境改變對魚類群體的影響，并進(jìn)一步從分子水平了解水利工程對生物多樣性的影響，為保護(hù)生態(tài)環(huán)境和魚類生物資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

研究所用標(biāo)本于2008年7月至2008年8月分別采自千島湖汾口（FK）、姜家鎮(zhèn)（JJZ）、富文（FW）、臨岐（LQ）4個(gè)地點(diǎn)。標(biāo)本用95%的酒精固定，儲(chǔ)存于4℃冰箱待用。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 基因組DNA采用酚-氯仿法[5]。溶解稀釋使其最終濃度為150 ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 線粒體COⅠ基因的擴(kuò)增 擴(kuò)增線粒體COⅠ基因的引物序列為：F：5′-CTA ARC RCT CGG CTA CCC TAC-3′；R：5′-GAG TGG TYA TGT GAC TGG CTT G-3′。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為：10×PCP buffer（Mg2+Plus）5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L 引物各 2.5 μL，Taq 酶 1.25 U，以及模板 DNA 375 ng，加滅菌雙蒸水至50 μL。Taq DNA聚合酶、標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA、dNTP等試劑，均為TaKaRa公司產(chǎn)品。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，59.5℃退火30 s和72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠（Ethidium bromide，EB）染色，凝膠成像系統(tǒng)檢測。將PCR產(chǎn)物送上海杰李生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 COⅠ基因部分片段分析 用獲得的COⅠ基因序列設(shè)計(jì)引物，產(chǎn)物片段大小為560 bp，上游引物位于510 bp處，下游引物位于1 070 bp處。上下游引物分別為：F：5′-ATG AAA CCG CCA GCC ATC TC-3′；R：5′-ACA ATT CCT GTT AGT CCG CCT-3′，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系同上。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；然后進(jìn)行94℃變性45 s，56.5℃退火30 s和72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將有單一明亮條帶的PCR產(chǎn)物送往上海杰李生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 雙向測序結(jié)果用DNAStar軟件進(jìn)行編輯校對，ClustalW 軟件[6]進(jìn)行序列重排和同源比較。用Arlequin 3.1軟件[7]計(jì)算群體的單倍型多樣性（h）和核苷酸多樣性（π），以及分子方差分析（AMOVA）和 Tajima′s D 值檢驗(yàn)[8]；并用 TCS 1.21軟件[9]對單倍型作最小拓展網(wǎng)絡(luò)（minimum spanning network）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體COⅠ基因全長

在COⅠ兩端保守的tRNA序列區(qū)域設(shè)計(jì)引物（F：5′CTA ARC RCT CGG CTA CCC TAC-3′；R：5′-GAG TGG TYA TGT GAC TGG CTT G-3′），對細(xì)鱗鲴基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示（圖1），具有明亮單一條帶。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙向測序，獲得了1 551 bp的細(xì)鱗鲴的COⅠ基因序列。

圖1 細(xì)鱗鲴線粒體COⅠ基因擴(kuò)增電泳圖譜

將獲得的序列與銀鲴（X.argentea）AP009059，黃尾鲴 （X.davidi）GQ289558 和圓吻鲴 （D.tumirostris）DQ026431進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明：此序列與銀鲴，黃尾鲴和圓吻鲴的COⅠ基因序列相似度分別為94%、94%和92%，具有較高同源性。

2.2 COⅠ基因序列分析

2.2.1 序列變異分析結(jié)果 線粒體COⅠ基因部分片段擴(kuò)增產(chǎn)物雙向測序后，共獲得4個(gè)群體84個(gè)個(gè)體COⅠ基因部分序列，長度為560 bp。部分?jǐn)U增產(chǎn)物電泳圖見圖2。4個(gè)群體COⅠ基因片段序列的A、T、G、C含量具有一定的偏倚性，A+T含量明顯高于G+C含量（表1）。84個(gè)樣本基因序列共有3個(gè)變異位點(diǎn)，分別發(fā)生在第45、264、395三個(gè)位點(diǎn)，4 個(gè)單倍型，分別為 hap1（FK1）、hap2（FK7）、hap3（LQ12）、hap4（FW26）；其中，F(xiàn)K、LQ 以及 FW 各有兩個(gè)單倍型，JJZ只有一種單倍型（表2）。其中，有一個(gè)共享單倍型，為4個(gè)群體共有。

圖2 560 bp的COⅠ基因部分片段序列擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

表1 細(xì)鱗鲴COⅠ基因部分片段堿基組成

表2 四個(gè)單倍型的變異位點(diǎn)及樣本數(shù)

2.2.2 種群遺傳結(jié)構(gòu)分析 FK群體的單倍型多樣性（h）和核苷酸多樣性（π）水平最高（表3），分別為0.500 0和0.001 9；其他3個(gè)群體單倍型多樣性（h）和核苷酸多樣性（π）水平較低。樣本的單倍型多樣性以及核苷酸多樣性都處于較低的水平，種群的遺傳多樣性水平低。Tajima′s D中性檢驗(yàn)結(jié)果表明，幾個(gè)群體的Tajima′s D值均未達(dá)到顯著水平。

表3 細(xì)鱗鲴線粒體COⅠ基因部分片段的遺傳多樣性

分子方差分析（AMOVA）結(jié)果見表4。在4個(gè)群體總的遺傳變異中，群體間遺傳變異占23.56%，群體內(nèi)遺傳變異占76.44%，可見群體內(nèi)變異是總變異的主要來源。但四群體總的遺傳分化指數(shù)FST值為0.235 6，差異不顯著，表明群體間沒有明顯的遺傳結(jié)構(gòu)變異。

表4 細(xì)鱗鲴四個(gè)群體的AMOVA分析

對所有單倍型做最小拓展網(wǎng)絡(luò)（minimum spanning network）分析表明（圖 3），F(xiàn)K1 是最主要、最原始的單倍型，其他的單倍型為拓展單倍型（方框內(nèi)的字符為單倍型編號）。

圖3 所有單倍型最小拓展網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

線粒體DNA是一種共價(jià)閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分子，其結(jié)構(gòu)簡單，呈母系遺傳，種群之間的遺傳差異易于被檢出，因此被廣泛地應(yīng)用于魚類種群分析的研究[2，10-11]。脊椎動(dòng)物線粒體多個(gè)蛋白編碼基因都包含有良好的系統(tǒng)發(fā)育信息[12]。COⅠ基因以及細(xì)胞色素b（cytb）兩個(gè)蛋白編碼基因在遺傳結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用最為廣泛。其中COⅠ基因進(jìn)化速率適中，既可用于種間分析，也適合于種群水平差異的檢測；cytb基因的結(jié)構(gòu)和功能研究的較為清楚，也適合于研究群體間的遺傳差異[13]。除了蛋白編碼基因，線粒體的控制區(qū)序列也是一個(gè)有效的分子標(biāo)記，其進(jìn)化速率稍快，被較多地應(yīng)用于近緣物種間的系統(tǒng)進(jìn)化以及種群遺傳結(jié)構(gòu)等方面的研究[10]。

本研究利用COⅠ基因兩端保守的tRNA編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物獲得了COⅠ基因序列全長，用部分COⅠ基因序列作為分子標(biāo)記對千島湖細(xì)鱗鲴群體進(jìn)行了分析。通過擴(kuò)增測序獲得了1 551 bp的細(xì)鱗鲴COⅠ基因序列全長，獲得的COⅠ基因序列與其他鲴屬魚類COⅠ基因序列相似度高，具有較高的同源性。利用部分COⅠ基因序列進(jìn)行種群分析結(jié)果表明，4個(gè)群體細(xì)鱗鲴部分COⅠ基因序列僅有3個(gè)變異位點(diǎn)，變異率很低，84個(gè)樣本僅有4個(gè)單倍型。核苷酸多樣性（π）是表示每個(gè)種群內(nèi)，各個(gè)單倍型的兩兩配對差異的平均值，是一個(gè)群體的遺傳多樣性指標(biāo)。較低核苷酸多樣性表明：一方面較低的遺傳多樣性水平說明千島湖細(xì)鱗鲴群體間的基因交流受到了一定的影響，另一方面表明線粒體COⅠ基因分子標(biāo)記作為檢測千島湖細(xì)鱗鲴群體遺傳多樣性的有效性有所欠缺。分子方差分析（AMOVA）結(jié)果顯示群體間的變異對總的變異貢獻(xiàn)較小，提示千島湖四群體間沒有產(chǎn)生遺傳分化。

[1] 肖武漢，張亞平.魚類線粒體的遺傳與進(jìn)化[J].水生生物學(xué)報(bào)，2000，24（4）：384-391.

[2] 張鳳英，馬凌波，施兆鴻，等.3種鯧屬魚類線粒體COⅠ基因序列變異及系統(tǒng)進(jìn)化[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2008，15（03）：392-399.

[3] 袁思平，吳仲寧，蔡惠鳳，等.樟溪河漁業(yè)資源調(diào)查及細(xì)鱗斜頜鲴人工繁育[J].寧波大學(xué)學(xué)報(bào)（理工版），2010，23（4）：31-34.

[4] 喬德亮，李思發(fā).細(xì)鱗斜頜鲴3個(gè)群體形態(tài)差異[J].生態(tài)學(xué)雜志，2010，29（12）：2425-2430.

[5] Sambrook J，F(xiàn)ritsch E F，Maniatis T.Molecular cloning：A laboratory manual[M].New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.

[6] Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al.The ClustalX windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic Acids Research，1997，25：4876-4882.

[7] Excoffier L，Laval G，Schneider S.Arlequin ver.3.0：An integrated software package for population genetics data analysis[J].Evolutionary Bioinformatics Online，2005，（1）：47-50.

[8] Tajima F.Evolutionary relationship of DNA sequences in finite populations[J].Genetics，1983，105：437-460.

[9] Clement M，Posada D，Crandall K A.TCS：a computer program to estimate gene genealogies[J].Molecular Ecology，2000，9（10）：1657-1660.

[10] 楊金權(quán)，胡雪蓮，唐文喬.長江及其南部鄰近水域刀鱭的種群遺傳結(jié)構(gòu)及種群歷史 [J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，17（5）：513-519.

[11] 彭士明，施兆鴻，侯俊利，等.銀鯧3個(gè)野生群體線粒體COⅠ基因的序列差異分析 [J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，18（4）：398-402.

[12] Zardoya R，Meyer A.Phylogenetic performance of mitochondrial protein-coding genes in resolving relationships among vertebrates[J].Molecular Biology and Evolution，1996，13（7）：933-942.