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    潮陽(yáng)草雞胚胎成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)

    2011-06-08 07:53:46邱東萍游柏壽
    湖南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2011年21期
    關(guān)鍵詞:草雞傳代貼壁

    丁 鴻,邱東萍,游柏壽

    (1.揭陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣東 揭陽(yáng) 522000;2.彭澤縣人民醫(yī)院,江西 彭澤 332700)

    潮陽(yáng)草雞是潮汕地區(qū)的一種優(yōu)良雞種,善覓食,抗病力強(qiáng),成活率高。屬瘦肉型,皮薄肉嫩,味道鮮美,香脆滑潤(rùn),適宜白切、清燉、鹽焗等,是傳統(tǒng)的宴客佳肴。本實(shí)驗(yàn)以潮陽(yáng)草雞胚胎組織為材料,進(jìn)行體外成纖維細(xì)胞的培養(yǎng),旨在為潮陽(yáng)草雞的育種提供細(xì)胞學(xué)方面的依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 供試材料 潮陽(yáng)草雞孵化蛋30枚,9~13日齡,購(gòu)自汕頭市白沙禽畜原種研究所種雞場(chǎng)。

    1.1.2 供試試劑 MEM(含Earle′s鹽)培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco,胰蛋白酶(Trypsin 1:250)購(gòu)自 Amresco,標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(Standard FBS)購(gòu)自Hyclone,臺(tái)盼藍(lán)購(gòu)自Sigma,青霉素、鏈霉素為國(guó)產(chǎn)。全培養(yǎng)基:MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清+100 IU/mL雙抗。

    1.2 方 法[1-3]

    1.2.1 原代培養(yǎng) 超凈工作臺(tái)內(nèi)取雞胚腿部肌肉組織置于小培養(yǎng)皿內(nèi),用1×PBS+1%雙抗漂洗4~5次,用眼科剪剪成1mm3左右大小,移入培養(yǎng)瓶壁,均勻分散,加入全培養(yǎng)液,倒置培養(yǎng)瓶,置CO2培養(yǎng)箱中(37.5℃,5%CO2),過(guò)夜。當(dāng)組織塊貼壁牢固時(shí),翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,不浸潤(rùn)組織塊。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)出后,及時(shí)更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

    1.2.2 傳代培養(yǎng) 當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%~90%匯合時(shí),可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。去舊培養(yǎng)液,加入預(yù)熱至37℃,0.75%的 NaCl溶液,清洗細(xì)胞 2~3次,然后加入0.25%的胰酶液,消化10~30 s,倒置顯微鏡下觀(guān)察。當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞胞質(zhì)回縮,細(xì)胞間隙增大時(shí),立即加入全培養(yǎng)液,細(xì)胞懸液計(jì)數(shù),按1∶2或1∶3的比例分瓶,放入溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

    1.2.3 細(xì)胞冷凍保存 將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞于24 h前更換新鮮全培養(yǎng)基。常規(guī)方法消化細(xì)胞,制備成單細(xì)胞懸液,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。1 000 r/min離心8min,收集細(xì)胞。視細(xì)胞數(shù)量多少加入凍存液(10%DMSO+90%FBS),調(diào)細(xì)胞密度到(3~5)×106mL,分裝入無(wú)菌塑料凍存管中,每支1 mL。將凍存管裝入裝有異丙醇的冷凍盒,-70℃冰箱過(guò)夜。次日提出安瓿,放入液氮罐中保存。

    1.2.4 冷凍細(xì)胞復(fù)蘇 從液氮罐中小心取出凍存管,迅速浸沒(méi)在37~40℃的溫水中并快速晃動(dòng),使細(xì)胞液在1~2min內(nèi)完全融解。吸出細(xì)胞懸液,加入到裝有全培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。置于37.5℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

    1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)性狀檢測(cè)

    1.3.1 細(xì)胞一般形態(tài)學(xué)觀(guān)察 在培養(yǎng)過(guò)程中,每天觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、培養(yǎng)液的pH值改變以及細(xì)胞是否污染等。并作好記錄,用相差顯微鏡拍照。

    1.3.2 制作細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)[4]取生長(zhǎng)狀態(tài)良好細(xì)胞,常規(guī)方法消化制成細(xì)胞懸液,按(1~5)×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度在24孔培養(yǎng)板中接種等量細(xì)胞。共設(shè)7組,每組3孔,置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從次日起,即開(kāi)始計(jì)算第一組每孔中的細(xì)胞數(shù),取3孔的平均值,如此至第7組結(jié)束。用Origin 6.1軟件繪成細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖。

    1.3.3 細(xì)胞凍存前及復(fù)蘇后細(xì)胞存活率 細(xì)胞冷凍前和細(xì)胞復(fù)蘇后,采用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)算細(xì)胞存活率。在Trypan染液中,健康活細(xì)胞胞體完整,細(xì)胞透明不著色,呈藍(lán)色者均為死細(xì)胞。計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞,計(jì)算細(xì)胞存活率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 胚胎成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)

    如圖1、圖2所示,組織塊貼附1~2 d后便可見(jiàn)細(xì)胞從組織塊周?chē)纬錾L(zhǎng),典型的成纖維樣,隨后迅速向外擴(kuò)散,呈明顯的火焰狀或放射狀走形。2~3 d后便可鋪滿(mǎn)瓶底,消化傳代。消化傳代后,細(xì)胞30 min便開(kāi)始部分貼壁。2~3 d便可長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底,此時(shí)細(xì)胞多發(fā)生粘連生長(zhǎng),呈網(wǎng)狀分布,細(xì)胞界線(xiàn)不甚清晰。長(zhǎng)滿(mǎn)后繼續(xù)消化傳代,如此直到冷凍保存。

    圖1 潮陽(yáng)草雞原代細(xì)胞

    圖2 潮陽(yáng)草雞傳代細(xì)胞

    2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)

    常規(guī)方法制備細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),接種24孔培養(yǎng)板,每孔1mL細(xì)胞懸液,2.0×105個(gè)細(xì)胞。連續(xù)7 d測(cè)得數(shù)據(jù)如表1所示。

    表1 潮陽(yáng)草雞細(xì)胞培養(yǎng)7 d細(xì)胞平均數(shù)表

    繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖,由圖3可以看出,細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)呈“S”型,主要經(jīng)歷潛伏生長(zhǎng)期、指數(shù)生長(zhǎng)期、水平靜止期3個(gè)時(shí)期。細(xì)胞的群體倍增時(shí)間約為24 h。在培養(yǎng)后期,細(xì)胞產(chǎn)生接觸抑制和密度抑制,生長(zhǎng)緩慢或停止生長(zhǎng)。

    圖3 潮陽(yáng)草雞細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)

    2.3 細(xì)胞凍存前及復(fù)蘇后細(xì)胞活率

    潮陽(yáng)草雞胚胎成纖維細(xì)胞在凍存前和凍存后的平均存活率分別達(dá)到94.8%和90.2%,表明細(xì)胞在生長(zhǎng)時(shí)健康狀況良好,培養(yǎng)條件適宜;凍存后解凍則存活率有所下降,表明細(xì)胞在冷凍和復(fù)蘇時(shí)可能受到一定的損傷。但在復(fù)蘇后培養(yǎng)30~60min內(nèi)便可見(jiàn)有細(xì)胞貼壁,4~6 h完全貼壁,與細(xì)胞傳代后貼壁相比,復(fù)蘇后細(xì)胞貼壁鋪展時(shí)間明顯延長(zhǎng),可達(dá)24~36 h,48 h后細(xì)胞基本長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底,可傳代培養(yǎng),傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)速度和凍存前基本一致。

    3 小結(jié)與討論

    本實(shí)驗(yàn)以潮汕地區(qū)地方優(yōu)質(zhì)雞種——潮陽(yáng)草雞胚胎為材料,在體外成功培養(yǎng)了成纖維細(xì)胞,并進(jìn)行了傳代和冷凍保存,復(fù)蘇后細(xì)胞的存活率仍達(dá)到90%以上,為潮陽(yáng)草雞的育種在細(xì)胞學(xué)方面提供了一定的科學(xué)依據(jù),也為學(xué)院的細(xì)胞培養(yǎng)工作搭建了技術(shù)平臺(tái)。

    細(xì)胞培養(yǎng)的最大危險(xiǎn)是發(fā)生培養(yǎng)物的細(xì)菌,真菌和病毒等微生物的污染[5-7],污染主要是由于操作者的疏忽而引起,常見(jiàn)的原因有操作間或周?chē)臻g的不潔,培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不徹底,由于有關(guān)培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)的失誤均能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗,故細(xì)胞培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)嚴(yán)格遵守操作常規(guī),防止發(fā)生污染[8]。

    [1] 鄂 征.組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù) [M].北京:北京出版社,1999.

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