甘肅高寒陰濕地區(qū)蠶豆苗期鐮刀菌根腐病病原鑒定

侯思雯，李敏權(quán)，楊曉明，楊發(fā)榮

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

蠶豆（Vicia faba L.）別名胡豆、寒豆、佛豆、羅漢豆等，原產(chǎn)西南亞一帶，是人類栽培的最古老的農(nóng)作物之一。甘肅臨夏地區(qū)高寒陰濕，地處青藏高原與黃土高原過(guò)渡地帶，年平均氣溫6.3℃，降水量537 mm，無(wú)霜期157 d，適宜春蠶豆種植,是甘肅省乃至全國(guó)蠶豆生產(chǎn)的重要基地之一[1]。近年來(lái)，土傳鐮刀菌根腐病日益嚴(yán)重，成為蠶豆生產(chǎn)的主要限制因素之一。據(jù)報(bào)道,重病田蠶豆死亡率達(dá)60%～90%,甚至絕收[2]。蠶豆鐮刀菌根腐病是一個(gè)世界性蠶豆病害，自1890年德國(guó)人Kirchmer報(bào)道以來(lái)，先后在美國(guó)、加拿大、意大利、蘇丹、中國(guó)等國(guó)家見諸報(bào)道。我國(guó)自俞大紱等1944年報(bào)道以來(lái)，在云南、浙江、江蘇、青海、甘肅等蠶豆栽培區(qū)均有病害發(fā)生及病原研究的報(bào)道，且多地報(bào)道的病原存在差別。本試驗(yàn)對(duì)甘肅臨夏地區(qū)蠶豆苗期鐮刀菌根腐病病原菌進(jìn)行分離鑒定，旨在明確危害該地區(qū)蠶豆生產(chǎn)的病原菌種類，為今后蠶豆的抗病育種和病害防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 田間調(diào)查與樣品采集

在蠶豆播種出苗后，分別于臨夏縣、康樂(lè)縣田間調(diào)查并采集具有典型根腐病的病株。所采標(biāo)本用聚乙烯袋保存，當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室分離。

1.2 病原菌的分離

采用常規(guī)的組織分離技術(shù)。將具有典型癥狀的蠶豆根經(jīng)流水沖洗12 h，再?gòu)牟〗〗唤缣幥腥?.5 cm大小的組織塊，使用0.1%升汞溶液進(jìn)行表面消毒1 min，用無(wú)菌水清洗3遍后，在滅菌濾紙上將水吸干，然后在無(wú)菌條件下置于PSA培養(yǎng)基平板上，25℃下培養(yǎng)。每天進(jìn)行觀察，待有肉眼可見的菌落出現(xiàn)時(shí)，取菌落前沿菌絲轉(zhuǎn)皿，繼續(xù)在25℃下培養(yǎng)備用[3]。

1.3 病原菌的純化

經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的菌株，在顯微鏡下初步鏡檢，對(duì)已產(chǎn)孢的，直接進(jìn)行單孢分離，對(duì)未產(chǎn)孢的經(jīng)制作CLA培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)孢后進(jìn)行單孢分離。置于PSA培養(yǎng)基25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 d后測(cè)定菌落生長(zhǎng)速率，觀察并記錄菌落培養(yǎng)性狀、色澤等形態(tài)學(xué)性狀[4-5]。

1.4 病原菌的鑒定

根據(jù)Booth.C和Lester B.分類系統(tǒng)[4-6]，將分離獲得的菌株進(jìn)行種的鑒定。

1.5 致病性的測(cè)定

蠶豆品種為臨蠶七號(hào)，由臨夏農(nóng)科所提供。采用盆栽法和平皿法進(jìn)行分離物的致病性測(cè)定。盆栽法：采用室內(nèi)盆栽土壤接菌的方法,按滅菌土壤5%的菌量混土育苗，每盆5株。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，于一個(gè)半月后調(diào)查發(fā)病情況[7]。平皿法：在25℃下，將待測(cè)分離物在PSA培養(yǎng)基上恒溫培養(yǎng)7 d后，打制直徑為5 mm的菌餅，轉(zhuǎn)入WA平板（150 mm）,25℃培養(yǎng)4 d，取蠶豆種子使用0.1%升汞溶液進(jìn)行表面消毒1 min，滅菌水沖洗3次,均勻排列在帶菌水瓊脂培養(yǎng)基上,每皿10粒。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，以不接菌的WA培養(yǎng)基上同樣處理10粒種子為對(duì)照，7 d后統(tǒng)計(jì)種子的發(fā)病率以及病情指數(shù)[8]。再?gòu)慕臃N發(fā)病的植株上分離病原物，與鑒定并接種的菌株進(jìn)行比較確認(rèn)。

觀察蠶豆胚根上的發(fā)病癥狀，病害共分5級(jí)：0級(jí)，健康無(wú)?。?級(jí)，幼苗胚根尖部位出現(xiàn)壞死斑點(diǎn)癥狀，但不軟腐；2級(jí)，幼苗胚根上出現(xiàn)變軟和腐爛癥狀；3級(jí)，壞死幼苗，萌發(fā)種子幼苗胚根腐爛；4級(jí)，霉?fàn)€壞死的種子或不萌發(fā)而腐爛的種子。發(fā)病率、病情指數(shù)的計(jì)算分別見式（1）、式（2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶豆根腐病田間癥狀表現(xiàn)

田間發(fā)病癥狀表現(xiàn)為發(fā)病植株生長(zhǎng)緩慢，植株矮小，葉片發(fā)黃，植株下部葉片葉緣變黑，產(chǎn)生大小不等黑色枯斑，嚴(yán)重時(shí)整葉變黑焦枯，甚至植株死亡。病株地下部分主根和根頸病部位變黑，有縊縮。

2.2 病原菌分離

對(duì)66株田間根腐病株進(jìn)行分離，共獲得34個(gè)鐮刀菌（Fusarium spp.）分離物,其分離頻率達(dá)51.52%。

2.3 病原菌鑒定

如表1所示，所得病原鐮刀菌分別是茄鐮刀菌（Fusarium solani）、半裸鐮刀菌（Fusarium semitectum）和單隔鐮刀菌（Fusarium dimerum）。病原菌的主要鑒定特征如下。

表1 蠶豆根腐病病原鐮刀菌分離

2.3.1 茄鐮刀菌（F.solani（Mart）Sacc.emend.Snyder&Hansen）在PSA培養(yǎng)基上，其生長(zhǎng)速率為3.1 cm，PSA基物背面觀察呈白色、近圓形、絨毛狀，菌絲內(nèi)有橫膈膜，大型分生孢子數(shù)量多，馬特形，頂部細(xì)胞鈍圓，基胞足跟不明顯；小型分生孢子數(shù)量多,橢圓形或卵形。厚垣孢子在菌絲中間產(chǎn)生，單瓶梗長(zhǎng)。

2.3.2 半裸鐮 刀菌 （F.semitectum Berk&Rav）PSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率為3.45 cm，PSA基物背面觀察初為白色，后至駝黃色，氣生菌絲繁茂。在WA培養(yǎng)基上呈白色而且菌絲稀疏。小型分生孢子少見，大型分生孢子有兩種形態(tài):其一為紡錘型，兩端均為楔形，多為3～5隔。其二為鐮刀型頂端楔形，基胞有明顯足跟，多為5隔。產(chǎn)孢細(xì)胞有兩種，分別是多芽生和復(fù)瓶梗，厚垣孢子球型，多串生，間或頂生。

2.3.3 單隔鐮刀菌（F.dimerum Penzig in Saccardo） 在PSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率為3.05 cm,PSA基物背面觀察為杏黃色，氣生菌絲繁茂，致密，絮狀。大型分生孢子短，中等偏窄，兩端稍尖，頂胞彎曲，單個(gè)隔膜，形態(tài)一致，在培養(yǎng)基與康乃馨葉片上產(chǎn)生橘紅色的分生孢子座，厚垣孢子在菌絲間單個(gè)間生或串生，表面光滑。

2.4 致病性測(cè)定

2.4.1 盆栽法致病性測(cè)定結(jié)果 盆栽法試驗(yàn)結(jié)果表明，接種的3種鐮刀菌都能致病，且引起的癥狀相似。具體表現(xiàn)為植株感病后，首先從根尖開始變色，進(jìn)而主根下半部出現(xiàn)褐色條斑，病斑多不凹陷，以后逐漸擴(kuò)大，表皮及皮層變黑壞死，葉片由下而上逐漸變黃，植株矮化，但病程進(jìn)展比較緩慢，嚴(yán)重時(shí)可造成整株死亡（表2）。

2.4.2 平皿法致病性測(cè)定結(jié)果 平皿測(cè)定結(jié)果見表3。接菌的種子在發(fā)芽9 d后陸續(xù)發(fā)病，幼苗初生根尖部開始出現(xiàn)壞死斑點(diǎn)癥狀，隨時(shí)間的推移，胚根上出現(xiàn)變軟及腐爛癥狀，直至萌發(fā)種子幼苗胚根腐爛，最終死亡。

由表3可知，不同菌種致病性強(qiáng)弱不同，在3種鐮刀菌不同菌株間致病性強(qiáng)弱也有顯著差異。其中，茄鐮刀菌1～18號(hào)，半裸鐮刀菌1～4號(hào)，單隔鐮刀菌1、2號(hào)為強(qiáng)致病性菌株；半裸鐮刀菌5～8號(hào)、10號(hào)，單隔鐮刀菌3～5號(hào)、7號(hào)為中等強(qiáng)度致病性菌株；半裸鐮刀菌9號(hào)，單隔鐮刀菌6號(hào)，為弱致病性菌株。

表2 鐮刀菌不同菌株致病性盆栽測(cè)定結(jié)果

表3 病原菌鐮刀菌致病性平皿法測(cè)定結(jié)果

3 討論

蠶豆鐮刀菌根部病害（Fusarium spp.）是一個(gè)世界性的病害，關(guān)于蠶豆鐮刀菌根腐病的病原，世界上不同蠶豆栽培地區(qū)的報(bào)道不盡相同。世界上最早報(bào)道蠶豆鐮刀菌根腐病的是德國(guó)人Kirchmer，該病的病原是禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum，1890）[10]；隨后Pape報(bào)道了蠶豆鐮刀菌基腐病，該病的病原是燕麥鐮刀菌 （F.avenaceum，1920）[10]；Miyake報(bào)道了蠶豆鐮刀菌枯萎病，該病的病原是禾谷鐮刀菌（F.graminearum，1924）[10]。從此，世界許多植物病理學(xué)家相繼報(bào)道了對(duì)蠶豆鐮刀菌根病病原的研究成果[4-20]。我國(guó)俞大紱對(duì)云南冬蠶豆鐮刀菌根部病害進(jìn)行了系統(tǒng)研究，通過(guò)癥狀表現(xiàn)，把蠶豆鐮刀菌根病分為3種類型，即蠶豆鐮刀菌枯萎病，病原是燕麥鐮刀菌蠶豆變種和尖孢鐮刀菌蠶豆變種（F.avenaceum var.fabae；F.oxysporium var.fabae）[10-11]；蠶豆鐮刀菌根腐病，病原是茄鐮刀菌和串珠鐮刀菌（F.solani；F.moniliforme）[12-13,15]；蠶豆鐮刀菌基腐病，病原是燕麥鐮刀菌和禾谷鐮刀菌（F.avenaceum；F.graminearum）[13-15]。這些研究成果為我國(guó)蠶豆鐮刀菌根病的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。其后，阮興業(yè)等研究報(bào)道了蠶豆苗期鐮刀菌基腐病，病原有尖孢鐮刀菌（F.oxysporium）、燕麥鐮刀菌（F.avenaceum）、串珠鐮刀菌（F.moniliforme）、禾谷鐮刀菌（F.graminearum）和木賊鐮刀菌（F.equiseti）；鐮刀菌基腐萎蔫病，病原是燕麥鐮刀菌蠶豆變種（F.avenaceum var.fabae）；鐮刀菌根腐病，病原是茄鐮刀菌（F.solani）和擬枝孢鐮刀菌（F.sporotrichioides）[17-19]。鮑建榮等報(bào)道了浙江省蠶豆鐮刀菌病害的病原主要有銳頂鐮刀菌（F.acuminatum）、尖孢鐮刀菌（F.oxysporium）、串珠鐮刀菌（F.moniliforme）、三線鐮刀菌（F.tricinctum）、串珠鐮刀菌膠孢變種（F.var.subglutinans）和茄鐮刀菌（F.solani）[16]。任海英等研究報(bào)道了江蘇常熟地區(qū)蠶豆枯萎病的病原主要是尖孢鐮刀菌（F.oxysporium）、燕麥鐮刀菌（F.avenaceum）、木賊鐮刀菌（F.equiseti）和串珠鐮刀菌（F.moniliforme）[7]。王曉鳴等鑒定青海省春蠶豆鐮刀菌根腐病病原為茄鐮刀菌（F.solani）；蠶豆鐮刀菌枯萎病的病原為尖孢鐮刀菌（F.oxysporium）[18]。李春杰等研究報(bào)道甘肅臨夏地區(qū)春蠶豆鐮刀菌根腐病的病原為茄鐮刀菌（F.solani）、尖孢鐮刀菌（F.oxysporium）和燕麥鐮刀菌（F.avenaceum）[2]。

本文報(bào)道的蠶豆鐮刀菌根腐病的病原茄鐮刀菌與之前的報(bào)道是一致的[2,12－13,15,17-18]；而病原半裸鐮刀菌和病原單隔鐮刀菌屬首次報(bào)道。單隔鐮刀菌對(duì)植物的致病性研究報(bào)道較少，有待進(jìn)一步研究。另外，茄鐮刀菌雖然可以引起多種植物根腐病，但存在幾十種致病?；停疚膱?bào)道的病原茄鐮刀菌對(duì)其他植物的致病性還有待進(jìn)一步研究。有文獻(xiàn)報(bào)道，蠶豆根腐病存在病原鐮刀菌與其他病原真菌復(fù)合侵染的情況[8,11,13]，關(guān)于這一問(wèn)題，尚有待深入細(xì)致的研究。

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