肝纖維化患者“益肝康”藥物血清對HSCs胞漿游離鈣的影響

王軍民 劉石萍 方澍名 姚希賢

肝纖維化(LF)是所有慢性肝病進(jìn)展成肝硬化的必經(jīng)階段，而肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)則是肝星狀細(xì)胞(HSCs)的活化與增殖，因此抑制HSCs活化與增殖則成為阻止并逆轉(zhuǎn)肝纖維化的主要途徑之一。經(jīng)大量臨床與基礎(chǔ)研究證實(shí)，中藥有效方劑“益肝康”對肝纖維化有相當(dāng)?shù)闹委熥饔茫?］。目前尚乏慢性乙型肝炎患者“益肝康”藥物血清對HSCs細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制影響的研究。本實(shí)驗(yàn)采用激光共聚焦顯微鏡(LSCM)與第三代鈣熒光探針Fluo-3/AM技術(shù)，觀察經(jīng)用慢性乙型肝炎患者制備的“益肝康”藥物血清對血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)介導(dǎo)的HSCs胞漿游離鈣(Ca2+i)變化的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病例選擇:河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科門診就診及病房住院之慢性乙型肝炎患者。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)符合5中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、病毒性肝炎防治方案6慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)年齡18～55歲，性別男性;(3)HBVDNA(+)的“小三陽”患者;(4)肝纖維化血清標(biāo)志物肝纖四項(xiàng)(HA、LN、PⅢP、IV-7s)有陽性表現(xiàn);(5)影像學(xué)檢查脾臟脾門處厚度4～4.5 cm，門靜脈主干及脾門靜脈內(nèi)徑正常;(6)研究期間同意不服用免疫調(diào)節(jié)劑、退黃藥物及其他中藥。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)合并其他類型肝炎者;(2)嚴(yán)重心、腎疾患者;(3)膽紅素＞5ULN;(4)近期(6個(gè)月)應(yīng)用免疫抑制或增強(qiáng)劑者;(5)肝硬化失代償期患者。

1.4 細(xì)胞株 肝星狀細(xì)胞株CFSC由美國Greenwel教授建株并惠贈(zèng)，其表型為活化的HSCs，從四氯化碳(CCl4)誘發(fā)的肝硬化大鼠中分離并通過培養(yǎng)使細(xì)胞自發(fā)獲得永生性［4］，冷凍保存于液氮中。

1.5 液體配制

1.5.1 正常含鈣細(xì)胞培養(yǎng)液/臺(tái)氏液:NaCl 130 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，CaCl21.5 mmol/L，MgCl22 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，glucose 10 mmol/L，pH 值7.4(NaOH)。

1.5.2 青霉素、鏈霉素雙抗溶液:使用濃度青霉素為100 U/ml，鏈霉素 100 μg/ml，配成 100 倍貯存液，－20℃ 貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 方法

1.6.1 藥物血清的提取及細(xì)胞培養(yǎng):采用改良血清藥理學(xué)方法，即采用慢性乙型肝炎患者進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)，再提取藥物血清進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，使體外實(shí)驗(yàn)盡量準(zhǔn)確再現(xiàn)在體藥物與機(jī)體相互作用過程。

1.6.2 患者血清分組:A組:服用“益肝康”前;B組:服用“益肝康”后。

1.6.3 藥物血清的制備:征求患者同意，簽定同意書，15名觀察對象服藥前采靜脈血5 ml，然后給予“益肝康”150 ml(1袋)，2次/d，療程7 d時(shí)作為觀察終點(diǎn)。服用“益肝康”前后，均于晨起外周靜脈取血，常溫靜置3 h，4℃離心，3000 r/min，20 min，分離血清，其中有溶血者棄之不用。同組血清合并混勻，56℃ ×30 min水浴滅活，用0.22 μm 濾器過濾除菌，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.4 細(xì)胞培養(yǎng) 將冷凍保存于液氮中的HSCs復(fù)蘇后接種于含10% 胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、4 mmol/L L-谷氨酰胺及1 mol/LHEPES的10%RPMI-1640培養(yǎng)液(pH值7.4)中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞呈單層致密狀時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化后以1∶3傳代，24 h換液，72 h再次傳代。

1.6.5 實(shí)驗(yàn)分組:每次實(shí)驗(yàn)均在呈指數(shù)生長的細(xì)胞中進(jìn)行，將2 cm×2 cm蓋玻片預(yù)先放置在6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞消化后以1.0×104/ml的密度接種2 ml制備爬片，培養(yǎng)箱中孵育至細(xì)胞80%融合時(shí)，棄培養(yǎng)液，換不含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞基本同步化于G0期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組如下(n=8):A組為服用“益肝康”前血清干預(yù)組;B組為服用“益肝康”后藥物血清干預(yù)組

1.6.6 藥物血清預(yù)處理:將上述爬片細(xì)胞分為2組，每孔加入10%RPMI-1640培養(yǎng)液900 μl，然后各實(shí)驗(yàn)孔采用盲法分別給予A組藥物血清或B組血清100 μl，終濃度為10%。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.7 檢測胞漿游離鈣 采用盲法，用10%藥物血清培養(yǎng)HSCs24 h，再將經(jīng)藥物血清預(yù)處理的HSCs及對照組細(xì)胞負(fù)載Fluo-3/AM后使用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)檢測Ca2+i。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSCs的Ca2+熒光成像 LSCM下Ca2+成像的HSCs仍可見普通倒置顯微鏡下的形態(tài)特征，細(xì)胞Ca2+i的濃度的高低由細(xì)胞被激發(fā)出的熒光強(qiáng)弱表示，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，表示Ca2+i濃度越高，反之則越低。本實(shí)驗(yàn)HSCs與Fluo-3/AM孵育后，所有細(xì)胞均被染色，且每組各細(xì)胞間的強(qiáng)度基本一致。

2.2 靜息狀態(tài)下HSCsCa2+i的動(dòng)態(tài)變化 為證明細(xì)胞培養(yǎng)液本身對HSCsCa2+i的影響，本研究觀察了6個(gè)HSCs在實(shí)驗(yàn)所需的時(shí)間內(nèi)(5 min)Ca2+i的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果表明，HSCs在實(shí)驗(yàn)所需的整個(gè)時(shí)間內(nèi)Ca2+i熒光強(qiáng)度基本保持穩(wěn)定。

2.3 不同濃度Ang-Ⅱ?qū)SCs的累積反應(yīng)曲線 加入濃度梯度Ang-Ⅱ后，HSCs熒光強(qiáng)度逐漸增加，作出累積反應(yīng)曲線后，得到EC50值約為1.1×10-7mol/L。

2.4 “益肝康”藥物血清對HSCsCa2+i的影響 經(jīng)“益肝康”藥物血清預(yù)處理HSCs后均可明顯減低細(xì)胞Ca2+i，熒光強(qiáng)度相對值(FI)與經(jīng)服藥前患者血清預(yù)處理HSCs組結(jié)果相比，Ca2+i下降達(dá)52.37%，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。見表 1、圖 1。

2.5 “益肝康”藥物血清對Ang-Ⅱ介導(dǎo)的HSCsCa2+i變化的影響 給予 Ang-Ⅱ(1.1×10－7mol/L)刺激 HSCs，經(jīng)“益肝康”藥物血清預(yù)處理的HSCs，細(xì)胞Ca2+i熒光強(qiáng)度變化百分?jǐn)?shù)(CRF)明顯減低，同經(jīng)服藥前患者血清預(yù)處理HSCs組結(jié)果相比，下降達(dá)90.50%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。見表1、圖2。

3 討論

圖1 “益肝康”藥物血清對HSCs胞漿游離鈣熒光強(qiáng)度相對值的影響

圖2 “益肝康”藥物血清漿游高鈣熒光強(qiáng)度變化百分?jǐn)?shù)的影響

表1 “益肝康”藥物血清對胞漿游離鈣熒光強(qiáng)度相對值及變化百分?jǐn)?shù)的影響n=8，

表1 “益肝康”藥物血清對胞漿游離鈣熒光強(qiáng)度相對值及變化百分?jǐn)?shù)的影響n=8，

注:與A組比較，*P ＜0.01

組別FI CRF A組53 ±15 1.000 ±0.370 B 組 25 ±7* 0.095 ±0.028*

目前研究認(rèn)為，生物信號(hào)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本途徑包括cAMP、cGMP、三磷酸肌醇(IP3)和Ca2+等系統(tǒng)。其中作為“信使之王”的Ca2+尤為重要，而其在細(xì)胞內(nèi)濃度的增加是細(xì)胞增殖分裂不可缺少的條件。在HSCs活化過程中，其胞漿內(nèi)Ca2+的是諸多生長因子、細(xì)胞因子及氧化應(yīng)激產(chǎn)物等發(fā)揮促生長和增殖作用的主要介質(zhì)之一。最近的許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HSCs上存在著L型-電壓依賴性鈣通道(L型-VOCC)，Oide等［2］發(fā)現(xiàn) HSCs尚含有T型電壓依賴性鈣通道(T型-VOCC)，且可被TGF-1激活。細(xì)胞外Ca2+可通過被激活的Ca2+通道流入細(xì)胞內(nèi)，加之胞內(nèi)鈣庫受損使Ca2+大量釋放，引起Ca2+i持續(xù)性升高，細(xì)胞內(nèi)外Ca2+i梯度降低，細(xì)胞去極化，興奮性增加，從而激活HSCs，使其增殖并大量表達(dá)膠原蛋白，加速肝纖維化的形成。郭傳勇等［3］觀察內(nèi)皮素-1對培養(yǎng)鼠肝星狀細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮素-1在促進(jìn)HSCs增殖及膠原合成的同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)游離鈣的水平也顯著升高，且Ca2+i濃度升高呈雙相反應(yīng)，一是快速短暫的瞬時(shí)峰值升高相(Ⅰ相);二是緩慢持久升高相 (Ⅱ相)。而且上述作用呈劑量依賴關(guān)系。推測Ⅱ相升高起主要作用，可進(jìn)一步激活c-fos、c-myc等癌基因表達(dá)，籍此調(diào)節(jié)HSCs細(xì)胞分裂和增殖的功能，并使HSCs分泌ECM能力增強(qiáng)。鐘敏章等［4］在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，用漢防己堿及維拉帕米治療可使HSCs數(shù)目減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)面積減少，線粒體、高爾基體產(chǎn)生與分泌膠原的細(xì)胞器均受到抑制，說明鈣通道阻斷劑抗肝纖維化作用部分與其抑制HSCs增殖及其向肌成纖維樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)，也暗示Ca2+i在HSCs活化與增殖中起著重要作用。

有研究表明，丹參及其提取物可抑制心肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)激所致鈣超載［5］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)慢性乙型肝炎患者提取的“益肝康”藥物血清預(yù)處理HSCs，與服藥前提取的患者血清預(yù)處理HSCs相比，前者鈣熒光強(qiáng)度明顯低于后者(P＜0.01)，顯示“益肝康”藥物血清顯著抑制了HSCs細(xì)胞內(nèi)鈣的升高。其機(jī)制可能是經(jīng)含藥血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，藥物發(fā)揮了其抑制HSCs鈣動(dòng)員的作用，推測該作用可能與“益肝康”的主藥-丹參阻斷了HSCs細(xì)胞膜上的L型-VOCC從而減少了鈣離子的內(nèi)流有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，在受到不同濃度的AngⅡ刺激時(shí)，HSCs-Ca2+i與AngⅡ成量效關(guān)系。提示AngⅡ可以通過提高Ca2+i而在HSCs的增殖中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚表明，給予Ang-Ⅱ刺激后，“益肝康”藥物血清預(yù)處理的HSCs，其Ca2+i熒光強(qiáng)度變化百分?jǐn)?shù)明顯低于服藥前血清預(yù)處理的HSCs(P＜0.001)，提示“益肝康”阻斷或抑制了HSCs的Ang-Ⅱ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，該通路可能是 Ang-Ⅱ激活的受體依賴性鈣通道(ROCC)，從而抑制了其致HSCs內(nèi)鈣升高的作用，并因此抑制HSCs活化與增殖。此機(jī)制可能與“益肝康”的主要組分——丹參下調(diào)AT-1受體水平密切相關(guān)。

1 房澍名，姚冬梅，王軍民，等.益肝康及其拆方對肝星狀細(xì)胞活化增殖及膠原代謝影響的研究.河北醫(yī)藥，2008，30:1481-1482.

2 Oide H，Itatsu T，Hirose M，et al.Acute and chronic effect of alcohol on Ca2+channels in hepatic stellate cells.Alcohol Clin Exp Res，2000，24:357-360.

3 郭傳勇，鄔贊斌，伍建業(yè)，等.內(nèi)皮素-1對培養(yǎng)鼠肝星狀細(xì)胞內(nèi)游離鈣的影響.中國病理生理雜志，2004，20:2118-2119.

4 鐘敏章，郭傳勇，王炳芳，等.內(nèi)皮素-1對肝星狀細(xì)胞增殖及膠原合成與分泌的調(diào)控作用.同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，23:273-275.

5 李金鳳，王孝銘，徐長慶，等.利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察丹參滴丸對乳鼠心肌細(xì)胞缺氧的保護(hù)作用.中國病理生理雜志，2000，16:1026.