黃連、大黃和苦參聯(lián)合應(yīng)用對金黃色葡萄球菌的體外抗菌活性研究

任書青 楊繼章 王長友

金黃色葡萄球菌(MRSA)是社區(qū)、醫(yī)院中內(nèi)源和外源性感染的主要病原菌，它致病性廣，耐藥性產(chǎn)生快;甲氧西林自1959年開始用于治療耐青霉素的葡萄球菌感染，1961年就產(chǎn)生了耐甲氧西林的MRSA。近年MRSA的陽性率迅速上升，其多重耐藥譜也不斷擴(kuò)大，再加上其耐藥性傳遞及多重耐藥譜迅速擴(kuò)大的機(jī)制至今還未闡明，MRSA已成為了世界性難題。MRSA對氨芐西林、四環(huán)素、利福平、亞胺培南、環(huán)丙沙星、慶大霉素、頭孢噻吩、頭孢噻肟、頭孢唑林的耐藥率均大于90.0%，對紅霉素、克林霉素和克拉霉素的耐藥率逐年下降;還未發(fā)現(xiàn)耐萬古霉素的MRSA［1］。因此，探討新的抗MRSA感染的藥物，已迫在眉睫。中草藥與西藥配伍尚能逆轉(zhuǎn)西藥的耐藥性［3］，因此，探討中西藥的配伍也具有廣闊的前景。

1 材料與方法

1.1 試藥 黃連(產(chǎn)地:四川)、大黃(產(chǎn)地:甘肅)、苦參(產(chǎn)地:內(nèi)蒙古)由河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院主管中藥師張一民鑒定為真品。MRSA菌種(臨床標(biāo)本分離菌株，由河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心提供)。ATCC25923標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌株(標(biāo)準(zhǔn)菌株，河北耐藥監(jiān)測中心提供)。MH培養(yǎng)基(北京三藥科技開發(fā)公司);MH肉湯(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)。

1.2 儀器 TDR-200B型自動微生物鑒定系統(tǒng)(湖南長沙天地人生物科技有限公司);DL-CJ-1F實(shí)驗(yàn)醫(yī)用型潔凈工作臺(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司北京分公司);DH3600AB型電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司);一次性使用培養(yǎng)板(姜堰市天力醫(yī)療器械有限公司，批號:20090218)。一次性痰杯(姜堰市瑞康醫(yī)療器械有限公司，批號:20090118)。

1.3 方法

1.3.1 藥液的準(zhǔn)備:取黃連、大黃和苦參，各3份，每份50 g，單獨(dú)和兩兩等比例混合后加適量的水浸泡30 min，然后用水煎煮，第1次1.0 h，第2、3次各0.5 h。合并3次濾液，加熱濃縮使原藥液濃度為1 g/ml;沸水浴滅菌45 min;再將黃連、大黃、黃連和大黃配伍液、黃連和苦參配伍液稀釋到100 mg/ml，備用。

1.3.2 藥液的配制:采用二倍稀釋法:取含8排12孔的一次性使用培養(yǎng)板，分別標(biāo)記，在標(biāo)號1～12孔中各加入MH肉湯培養(yǎng)液100 μl，在每排的第1孔各加入原藥液(100 mg/ml)100 μl，將第1孔混勻后，抽取100 μl加入第2孔，將第2孔混勻后再抽取100 μl加入第3孔，依次倍比稀釋至第10孔，將第10孔混勻后抽取100 μl棄取，第11孔為陰性對照，第12孔為陽性對照。1 ～10 孔中藥液濃度依次為:50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.57、0.79、0.39、0.20、0.10 mg/ml。其中苦參及大黃和苦參的藥液濃度 1 ～10 孔依次為:500.00、250.00、125.00、62.50、31.30、15.70、7.90、3.90、2.00、1.00 mg/ml。

1.3.3 菌種的制備:用接種環(huán)挑取MRSA菌落，接種于MH肉湯培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)挑取較大菌落2～3個，移至2 ml滅菌注射用水中，待檢前調(diào)節(jié)菌液濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡岫?。?MH肉湯培養(yǎng)液1∶10稀釋(含菌量為107cfu/ml)，供測定MIC用。

1.3.4 接種:用微量加樣器取100 μl MRSA菌液，依次加入各孔中(第11孔除外)，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長情況，培養(yǎng)液澄清的為陰性(即無細(xì)菌生長)，培養(yǎng)液混濁的為陽性(即有細(xì)菌生長)。以此確定藥液的MIC，MIC50，MIC90值。

2 結(jié)果

2.1 黃連、大黃、苦參單藥及兩兩配伍后對MRSA的 MIC，MIC50，MIC90值 見表1。

2.2 FIC指數(shù)計(jì)算 FIC指數(shù)=A藥聯(lián)合時MIC/A藥單用時MIC+B藥聯(lián)合時MIC/B藥單用時MIC。當(dāng)FIC指數(shù)≤0.5時，為協(xié)同作用;當(dāng)1≥FIC指數(shù)＞0.5時，為相加作用;當(dāng)2≥FIC指數(shù)＞1時，藥物體外的相互作用方式為無關(guān);當(dāng)FIC指數(shù)＞2時，為拮抗作用。

表1 黃連、大黃、苦參及其相互配伍后對MRSA 的 MIC、MIC50、MIC90 值 mg/ml

對MIC90其FIC指數(shù)如下:(1)黃連-大黃FIC指數(shù)=4.21，F(xiàn)IC 指數(shù) ＞2，為拮抗作用;(2)黃連-苦參 FIC 指數(shù) =1.01，2≥FIC指數(shù)＞1，藥物體外的相互作用方式為無關(guān);(3)大黃-苦參 FIC 指數(shù) =0.69，1≥FIC 指數(shù) ＞0.5時，為相加作用。

對MIC50 FIC指數(shù)如下:(1)黃連-大黃FIC指數(shù) =4.28，F(xiàn)IC指數(shù) ＞2，為拮抗作用;(2)黃連-苦參 FIC指數(shù) =1.01，2≥FIC指數(shù)＞1，藥物體外的相互作用方式為無關(guān);(3)大黃-苦參FIC 指數(shù) =0.69，1≥FIC 指數(shù) ＞0.5時，為相加作用。

3 討論

中草藥與抗生素相比具有以下優(yōu)點(diǎn)［3］:(1)具備非特異性抗菌作用并能調(diào)節(jié)及提高機(jī)體免疫力;(2)不良反應(yīng)小，在體內(nèi)藥物殘留量低;(3)細(xì)菌較少對中藥產(chǎn)生耐藥。因此，研究探索抗MRSA的中草藥前景廣闊。

黃連具有良好的抗菌作用，而且與多種中草藥配伍呈現(xiàn)出協(xié)同作用，在臨床應(yīng)用廣泛，是一種具有廣闊前景的中草藥［4，5］。但由于黃連中含有大量生物堿，當(dāng)與大多數(shù)中草藥配伍時，易產(chǎn)生沉淀，從而影響其藥效的發(fā)揮。因此，對含有黃連的復(fù)方制劑的提取，應(yīng)從工藝上進(jìn)行改進(jìn)，以減少沉淀的產(chǎn)生，充分發(fā)揮黃連的療效。

本研究顯示，無論對MIC50而言，還是對MIC90而言，黃連與大黃配伍均呈現(xiàn)出拮抗作用，黃連和苦參配伍呈現(xiàn)無關(guān)作用，只有大黃和苦參配伍方呈現(xiàn)出相加作用。

本課題旨在探討中草藥聯(lián)合應(yīng)用對MRSA感染的治療作用，從本次試驗(yàn)數(shù)據(jù)來看，大黃和苦參配伍呈現(xiàn)相加作用，黃連與大黃配伍呈現(xiàn)拮抗作用，黃連和苦參配伍呈現(xiàn)無關(guān)作用，但這僅代表體外作用的結(jié)果，至于體內(nèi)作用如何，有待進(jìn)一步的研究。本文采用水煎劑型，與臨床常用的服藥劑型相同，結(jié)果具有可借鑒性。

1 郭靚，范紅，陳知行，等.華西醫(yī)院5年耐甲氧西林金黃色葡萄球菌醫(yī)院感染調(diào)查.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2009，19:1151-1154.

2 曾春蘭，鐘振國.中藥抗菌作用的研究進(jìn)展.廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006，9:51-53.

3 陳勇川，謝林利，熊麗蓉，等.黃芩苷/黃芩素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗藥性的逆轉(zhuǎn)作用研究.中國藥房，2008，19:644-645.

4 徐帆，李平，楚更五，等.3種中藥提取物對幽門螺桿菌的體外聯(lián)合抗菌效應(yīng)研究.中國藥房，2007，18:2573-2574.

5 任書青，曹德英，楊繼章，等.五倍子、黃芩和黃連聯(lián)合應(yīng)用對MRSA的體外抗菌活性研究.中國藥房，2010，21:198-199.