豆角皂苷的純化工藝研究

李 健，吳佳慧，黎晨晨

(哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，哈爾濱 150076)

豆角作為膳食蛋白質(zhì)的重要來源，其中毒事件的頻繁發(fā)生使很多人對其食用的安全性產(chǎn)生了置疑［1］.目前僅我國國內(nèi)的豆角品種就多達數(shù)千種，由于毒素成分復(fù)雜而難以進行全面系統(tǒng)的研究調(diào)查［2］.國內(nèi)外對以上方面的研究報道極為少見.當前國內(nèi)外學術(shù)界一般認為，豆角中主要含有血細胞凝集素和皂苷兩種毒素［3］.皂苷是苷類中結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的化合物.它們廣泛存在于植物體內(nèi)，種類繁多，組成復(fù)雜［4］.前期確定了豆角皂苷的提取工藝，本實驗采用大孔樹脂純化分離等手段，以得率和質(zhì)量比為主要考查指標，就豆角皂苷的提取分離純化進行研究，旨在能給豆角皂苷的結(jié)構(gòu)研究提供一些可參考的微觀指標和實驗的依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料:溶劑浸提超聲輔助法制得的豆角皂苷粗提液

試劑:人參皂苷Rg1，購于黑龍江省藥檢所;D101型大孔吸附樹脂;無水乙醇、甲醇、氫氧化鈉、鹽酸、香草醛、冰乙酸、高氯酸等均為分析純試劑.

1.2 儀器與設(shè)備

植物粉碎機FZ102型 天津泰斯特儀器有限公司;電子天平FA2004N 上海精密科學儀器有限公司;RE52－98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;KQ型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;722E分光光度計 上海光譜儀器有限公司.

2 實驗方法與步驟

2.1 豆角皂苷靜態(tài)吸附及解吸實驗

1)靜態(tài)吸附方法

精確稱取經(jīng)預(yù)處理6 g的濕樹脂3份，置于具塞磨口三角瓶中，加入豆角皂苷質(zhì)量比為4.314mg/g的豆角皂苷粗提液各50mL，蓋緊瓶塞，于室溫下振蕩，充分吸附后過濾，測定濾液中剩余皂苷質(zhì)量分數(shù)，按下式計算吸附率和吸附量:

其中:C0為吸附前質(zhì)量濃度(mg/mL);Ce為吸附后質(zhì)量濃度(mg/mL);E為吸附率(%);Q為吸附量(mg/g);V為溶液體積(mL);W為樹脂干重(g).

2)靜態(tài)解吸方法

向濾去吸附液并達到吸附平衡的樹脂中加入50mL 70%的乙醇，室溫下連續(xù)振蕩，充分解吸后過濾，測定濾液的皂苷質(zhì)量濃度，按下式計算解吸率:

其中:C1為解吸后溶液質(zhì)量濃度(mg/mL);V1為解吸后溶液體積(mL);C0為吸附前溶液質(zhì)量濃度(mg/mL);Ce為吸附后溶液質(zhì)量濃度(mg/mL);V為吸附液體積(mL).

2.2 豆角皂苷動態(tài)吸附及解吸實驗

1)上樣pH值的確定

將豆角皂苷粗提物水溶液調(diào)至不同的pH值，上柱，靜置一段時間后，測定流出液的皂苷質(zhì)量比，計算吸附量，確定吸附液的最適pH值.

2)洗脫劑及其體積分數(shù)的選擇

準確吸取一定量的提取液上柱，靜置后，先用水洗脫，再依次用同體積的20% ～90%的乙醇溶液進行洗脫，收集洗脫液并測定其中皂苷的體積分數(shù)，以確定最佳的洗脫劑體積分數(shù).

3)最佳吸附時間的確定

將豆角皂苷的粗提取液加入到樹脂柱中，靜置20、30、40、50、60、70、80min 時間后，測定流出液的總皂苷質(zhì)量比，確定最佳的解析時間.

4)最佳上樣量的確定

將精確稱取的10 g濕樹脂裝柱后，取不同于樹脂體積比例為 1、2、4、6、8、10、12 的豆角皂苷粗提液吸附一定時間，通過對流出液中的總皂苷質(zhì)量比的測定，確定最佳上樣量.

5)洗脫劑用量的確定

精確吸取一定量提取液上柱，靜置一定時間后，依次用蒸餾水，低體積分數(shù)乙醇溶液，再用與樹脂體積比為2、4、6、8、10、12 的乙醇溶液進行解吸，測定流出液總皂苷質(zhì)量比，計算解吸率，確定洗脫劑的最佳用量.

6)最佳解吸時間的確定

將達到吸附飽和的樹脂用蒸餾水沖洗，用一定體積分數(shù)的乙醇洗脫，洗脫液每10min收集1次，收集8份，測定總皂苷質(zhì)量比，確定解吸時間.

2.3 豆角總皂苷質(zhì)量比的測定方法

2.3.1 標準曲線的繪制

人參皂苷Rg1標準液的配制:準確稱取干燥至恒重的人參皂苷Rg1標準品5.0mg，加甲醇溶解并定容至10mL，搖勻.分別準確吸取標準溶液0.060、0.120、0.180、0.240、0.300、0.360mL 于具塞試管中，水浴揮干溶劑，加入新配制的5%香草醛－冰乙酸溶液0.20mL，高氯酸0.80mL，蓋塞，混勻，在60℃水浴中加熱25min，冰水冷卻5min，加入冰醋酸5mL，搖勻，靜置10min，在波長546 nm處測定吸光度，進行空白對照.以皂苷質(zhì)量比為縱坐標，吸光度(A)為橫坐標，繪制標準曲線，擬合得回歸方程:y=0.2485 x－0.0012(R2=0.9981)

圖1 人參皂苷Rg1標準曲線

2.3.2 豆角皂苷質(zhì)量比測定

準確稱取豆角總皂苷提取物10.0mg，加甲醇定容至10mL，搖勻.準確移取0～20mL于具塞試管中，其余步驟與標準曲線的制作方法相同，測其吸光度［5－6］.

皂苷質(zhì)量比(mg/g)=測得豆角皂苷質(zhì)量比/所用脫脂豆角粉量

3 結(jié)果與討論

3.1 豆角皂苷靜態(tài)吸附及解吸實驗結(jié)果

經(jīng)計算得出D101型大孔樹脂的吸附量約為38.56mg/g(樹脂)，解析率約為 86.84%.

3.2 動態(tài)吸附及解吸的最佳條件

1)上樣pH值

結(jié)果見圖2，當pH值呈弱堿性時，大孔樹脂對豆角皂苷的選擇吸附性能好(色素吸附少，有明顯的脫色效果)，這可能和豆角皂苷是非離子性物質(zhì)有關(guān).在提取豆角皂苷時，色素也會被抽提出來，這些色素多為酚類物質(zhì)，和豆角皂苷極性相似，難以分離.在堿性條件下，色素轉(zhuǎn)換為鹽而溶于水，不易被樹脂吸附;另外，豆角皂苷在堿性條件下比較穩(wěn)定，因此，豆角皂苷溶液的pH值選8.

2)最佳吸附時間

將調(diào)好pH值為8的提取液以1.0mL/min的流速加入到樹脂柱中，靜置不同時間，測定流出液的總皂苷質(zhì)量比，結(jié)果見圖3.如圖3所示，靜置時間為40～70min時吸附曲線呈上升趨勢，而后即趨勢平緩.時間過短吸附不完全，用水沖洗時，皂苷成分會被帶走，因而吸附率較低;而時間過長又將難以解吸.原因是吸附是以物理吸附為主、伴隨化學吸附的過程，進行的較慢，當時間為70min時吸附即達到平衡.因此靜置時間70min為吸附最佳點.

3)洗脫劑體積分數(shù)

選擇D101大孔樹脂濕法裝柱，將豆角皂苷溶液調(diào)成pH值為8過柱，吸附飽和后，先用蒸餾水水洗脫，然后選用不同體積分數(shù)的乙醇進行解吸.實驗結(jié)果見圖4.由圖4可知，當乙醇體積分數(shù)為20%～30%時，洗脫液中皂苷很少;當乙醇體積分數(shù)為50% ～70%時，洗脫液中皂苷質(zhì)量比較高;而當乙醇體積分數(shù)為80%或更大時，洗脫液中皂苷質(zhì)量比逐漸減少.其中以70%的乙醇洗脫液中的皂苷質(zhì)量比最高.因此優(yōu)選的洗脫條件為依次用蒸餾水，20%乙醇溶液及70%乙醇溶液進行洗脫，收集70%乙醇的洗脫液.

圖4 洗脫劑體積分數(shù)對皂苷質(zhì)量比的影響

4)最佳上樣量

在樹脂柱中加入不同量的豆角皂苷粗提液，吸附70min后，測定解析液中總皂苷的質(zhì)量比.結(jié)果如圖5所示，隨著上樣量的增加，吸附率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢.在二者比例為1～8時，下降趨勢緩慢;繼續(xù)增大比例，吸附率下降幅度增大，此時已超過了樹脂的飽和吸附量，已有部分皂苷成分損失.而上柱量太少，純化周期過長，因此從出于對實驗周期和濟因素考慮，吸附液量與樹脂的最佳比例為8∶1.

圖5 上樣液量對吸附率的影響

5)洗脫劑的體積

在吸附飽和的大孔樹脂柱中，先用水洗脫，再用20%乙醇溶液洗脫，最后加入不同體積的70%的乙醇溶液測定洗脫液中總皂苷質(zhì)量比，計算解吸率，結(jié)果見圖6.由圖6可知，隨著洗脫劑用量的增大，解吸率提高，但當洗脫劑量大于8時解吸率的增大幅度已不明顯，從節(jié)省溶劑的角度考慮，選擇洗脫劑乙醇的量與樹脂體積比例為8∶1.

圖6 洗脫劑用量對解析率的影響

6)最佳解析時間

在吸附飽和的樹脂柱中，先用水洗脫，再用20%乙醇洗脫，最后用加入8倍于樹脂量70%乙醇進行洗脫，測定靜置不同時間的洗脫液皂苷質(zhì)量比，結(jié)果見圖7.如圖7所示，隨著解析時間的增加，皂苷量也逐漸增大，在解吸時間達到60min后質(zhì)量比無明顯增加，這時解吸基本完全，出于對純化周期的考慮，將最佳解吸時間定為為60min.

圖7 解析時間對皂苷質(zhì)量比的影響

4 結(jié)語

綜上可知，豆角總皂苷純化的最佳工藝條件為:上樣pH值為8，上樣液量為8倍樹脂體積，吸附70min，依次用蒸餾水、20%乙醇溶液、8倍樹脂體積分數(shù)70%的乙醇溶液進行洗脫，解析60min后，收集70%乙醇的洗脫液，減壓濃縮后真空干燥得到豆角皂苷純化物.經(jīng)過大孔樹脂純化后豆角總皂苷純化物的純度為54.61%，比豆角皂苷純度提高了28.47%，為接下來豆角皂苷的繼續(xù)精制及其結(jié)構(gòu)研究奠定了基礎(chǔ).

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