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    豆角皂苷的純化工藝研究

    2011-06-08 03:35:24吳佳慧黎晨晨
    關(guān)鍵詞:質(zhì)量

    李 健,吳佳慧,黎晨晨

    (哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,哈爾濱 150076)

    豆角作為膳食蛋白質(zhì)的重要來(lái)源,其中毒事件的頻繁發(fā)生使很多人對(duì)其食用的安全性產(chǎn)生了置疑[1].目前僅我國(guó)國(guó)內(nèi)的豆角品種就多達(dá)數(shù)千種,由于毒素成分復(fù)雜而難以進(jìn)行全面系統(tǒng)的研究調(diào)查[2].國(guó)內(nèi)外對(duì)以上方面的研究報(bào)道極為少見(jiàn).當(dāng)前國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界一般認(rèn)為,豆角中主要含有血細(xì)胞凝集素和皂苷兩種毒素[3].皂苷是苷類中結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的化合物.它們廣泛存在于植物體內(nèi),種類繁多,組成復(fù)雜[4].前期確定了豆角皂苷的提取工藝,本實(shí)驗(yàn)采用大孔樹(shù)脂純化分離等手段,以得率和質(zhì)量比為主要考查指標(biāo),就豆角皂苷的提取分離純化進(jìn)行研究,旨在能給豆角皂苷的結(jié)構(gòu)研究提供一些可參考的微觀指標(biāo)和實(shí)驗(yàn)的依據(jù).

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    材料:溶劑浸提超聲輔助法制得的豆角皂苷粗提液

    試劑:人參皂苷Rg1,購(gòu)于黑龍江省藥檢所;D101型大孔吸附樹(shù)脂;無(wú)水乙醇、甲醇、氫氧化鈉、鹽酸、香草醛、冰乙酸、高氯酸等均為分析純?cè)噭?

    1.2 儀器與設(shè)備

    植物粉碎機(jī)FZ102型 天津泰斯特儀器有限公司;電子天平FA2004N 上海精密科學(xué)儀器有限公司;RE52-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;KQ型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;722E分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司.

    2 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

    2.1 豆角皂苷靜態(tài)吸附及解吸實(shí)驗(yàn)

    1)靜態(tài)吸附方法

    精確稱取經(jīng)預(yù)處理6 g的濕樹(shù)脂3份,置于具塞磨口三角瓶中,加入豆角皂苷質(zhì)量比為4.314mg/g的豆角皂苷粗提液各50mL,蓋緊瓶塞,于室溫下振蕩,充分吸附后過(guò)濾,測(cè)定濾液中剩余皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù),按下式計(jì)算吸附率和吸附量:

    其中:C0為吸附前質(zhì)量濃度(mg/mL);Ce為吸附后質(zhì)量濃度(mg/mL);E為吸附率(%);Q為吸附量(mg/g);V為溶液體積(mL);W為樹(shù)脂干重(g).

    2)靜態(tài)解吸方法

    向?yàn)V去吸附液并達(dá)到吸附平衡的樹(shù)脂中加入50mL 70%的乙醇,室溫下連續(xù)振蕩,充分解吸后過(guò)濾,測(cè)定濾液的皂苷質(zhì)量濃度,按下式計(jì)算解吸率:

    其中:C1為解吸后溶液質(zhì)量濃度(mg/mL);V1為解吸后溶液體積(mL);C0為吸附前溶液質(zhì)量濃度(mg/mL);Ce為吸附后溶液質(zhì)量濃度(mg/mL);V為吸附液體積(mL).

    2.2 豆角皂苷動(dòng)態(tài)吸附及解吸實(shí)驗(yàn)

    1)上樣pH值的確定

    將豆角皂苷粗提物水溶液調(diào)至不同的pH值,上柱,靜置一段時(shí)間后,測(cè)定流出液的皂苷質(zhì)量比,計(jì)算吸附量,確定吸附液的最適pH值.

    2)洗脫劑及其體積分?jǐn)?shù)的選擇

    準(zhǔn)確吸取一定量的提取液上柱,靜置后,先用水洗脫,再依次用同體積的20% ~90%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫,收集洗脫液并測(cè)定其中皂苷的體積分?jǐn)?shù),以確定最佳的洗脫劑體積分?jǐn)?shù).

    3)最佳吸附時(shí)間的確定

    將豆角皂苷的粗提取液加入到樹(shù)脂柱中,靜置20、30、40、50、60、70、80min 時(shí)間后,測(cè)定流出液的總皂苷質(zhì)量比,確定最佳的解析時(shí)間.

    4)最佳上樣量的確定

    將精確稱取的10 g濕樹(shù)脂裝柱后,取不同于樹(shù)脂體積比例為 1、2、4、6、8、10、12 的豆角皂苷粗提液吸附一定時(shí)間,通過(guò)對(duì)流出液中的總皂苷質(zhì)量比的測(cè)定,確定最佳上樣量.

    5)洗脫劑用量的確定

    精確吸取一定量提取液上柱,靜置一定時(shí)間后,依次用蒸餾水,低體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液,再用與樹(shù)脂體積比為2、4、6、8、10、12 的乙醇溶液進(jìn)行解吸,測(cè)定流出液總皂苷質(zhì)量比,計(jì)算解吸率,確定洗脫劑的最佳用量.

    6)最佳解吸時(shí)間的確定

    將達(dá)到吸附飽和的樹(shù)脂用蒸餾水沖洗,用一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫,洗脫液每10min收集1次,收集8份,測(cè)定總皂苷質(zhì)量比,確定解吸時(shí)間.

    2.3 豆角總皂苷質(zhì)量比的測(cè)定方法

    2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)液的配制:準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg,加甲醇溶解并定容至10mL,搖勻.分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.060、0.120、0.180、0.240、0.300、0.360mL 于具塞試管中,水浴揮干溶劑,加入新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液0.20mL,高氯酸0.80mL,蓋塞,混勻,在60℃水浴中加熱25min,冰水冷卻5min,加入冰醋酸5mL,搖勻,靜置10min,在波長(zhǎng)546 nm處測(cè)定吸光度,進(jìn)行空白對(duì)照.以皂苷質(zhì)量比為縱坐標(biāo),吸光度(A)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,擬合得回歸方程:y=0.2485 x-0.0012(R2=0.9981)

    圖1 人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)曲線

    2.3.2 豆角皂苷質(zhì)量比測(cè)定

    準(zhǔn)確稱取豆角總皂苷提取物10.0mg,加甲醇定容至10mL,搖勻.準(zhǔn)確移取0~20mL于具塞試管中,其余步驟與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法相同,測(cè)其吸光度[5-6].

    皂苷質(zhì)量比(mg/g)=測(cè)得豆角皂苷質(zhì)量比/所用脫脂豆角粉量

    3 結(jié)果與討論

    3.1 豆角皂苷靜態(tài)吸附及解吸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    經(jīng)計(jì)算得出D101型大孔樹(shù)脂的吸附量約為38.56mg/g(樹(shù)脂),解析率約為 86.84%.

    3.2 動(dòng)態(tài)吸附及解吸的最佳條件

    1)上樣pH值

    結(jié)果見(jiàn)圖2,當(dāng)pH值呈弱堿性時(shí),大孔樹(shù)脂對(duì)豆角皂苷的選擇吸附性能好(色素吸附少,有明顯的脫色效果),這可能和豆角皂苷是非離子性物質(zhì)有關(guān).在提取豆角皂苷時(shí),色素也會(huì)被抽提出來(lái),這些色素多為酚類物質(zhì),和豆角皂苷極性相似,難以分離.在堿性條件下,色素轉(zhuǎn)換為鹽而溶于水,不易被樹(shù)脂吸附;另外,豆角皂苷在堿性條件下比較穩(wěn)定,因此,豆角皂苷溶液的pH值選8.

    2)最佳吸附時(shí)間

    將調(diào)好pH值為8的提取液以1.0mL/min的流速加入到樹(shù)脂柱中,靜置不同時(shí)間,測(cè)定流出液的總皂苷質(zhì)量比,結(jié)果見(jiàn)圖3.如圖3所示,靜置時(shí)間為40~70min時(shí)吸附曲線呈上升趨勢(shì),而后即趨勢(shì)平緩.時(shí)間過(guò)短吸附不完全,用水沖洗時(shí),皂苷成分會(huì)被帶走,因而吸附率較低;而時(shí)間過(guò)長(zhǎng)又將難以解吸.原因是吸附是以物理吸附為主、伴隨化學(xué)吸附的過(guò)程,進(jìn)行的較慢,當(dāng)時(shí)間為70min時(shí)吸附即達(dá)到平衡.因此靜置時(shí)間70min為吸附最佳點(diǎn).

    3)洗脫劑體積分?jǐn)?shù)

    選擇D101大孔樹(shù)脂濕法裝柱,將豆角皂苷溶液調(diào)成pH值為8過(guò)柱,吸附飽和后,先用蒸餾水水洗脫,然后選用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇進(jìn)行解吸.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4.由圖4可知,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%~30%時(shí),洗脫液中皂苷很少;當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50% ~70%時(shí),洗脫液中皂苷質(zhì)量比較高;而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%或更大時(shí),洗脫液中皂苷質(zhì)量比逐漸減少.其中以70%的乙醇洗脫液中的皂苷質(zhì)量比最高.因此優(yōu)選的洗脫條件為依次用蒸餾水,20%乙醇溶液及70%乙醇溶液進(jìn)行洗脫,收集70%乙醇的洗脫液.

    圖4 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)皂苷質(zhì)量比的影響

    4)最佳上樣量

    在樹(shù)脂柱中加入不同量的豆角皂苷粗提液,吸附70min后,測(cè)定解析液中總皂苷的質(zhì)量比.結(jié)果如圖5所示,隨著上樣量的增加,吸附率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì).在二者比例為1~8時(shí),下降趨勢(shì)緩慢;繼續(xù)增大比例,吸附率下降幅度增大,此時(shí)已超過(guò)了樹(shù)脂的飽和吸附量,已有部分皂苷成分損失.而上柱量太少,純化周期過(guò)長(zhǎng),因此從出于對(duì)實(shí)驗(yàn)周期和濟(jì)因素考慮,吸附液量與樹(shù)脂的最佳比例為8∶1.

    圖5 上樣液量對(duì)吸附率的影響

    5)洗脫劑的體積

    在吸附飽和的大孔樹(shù)脂柱中,先用水洗脫,再用20%乙醇溶液洗脫,最后加入不同體積的70%的乙醇溶液測(cè)定洗脫液中總皂苷質(zhì)量比,計(jì)算解吸率,結(jié)果見(jiàn)圖6.由圖6可知,隨著洗脫劑用量的增大,解吸率提高,但當(dāng)洗脫劑量大于8時(shí)解吸率的增大幅度已不明顯,從節(jié)省溶劑的角度考慮,選擇洗脫劑乙醇的量與樹(shù)脂體積比例為8∶1.

    圖6 洗脫劑用量對(duì)解析率的影響

    6)最佳解析時(shí)間

    在吸附飽和的樹(shù)脂柱中,先用水洗脫,再用20%乙醇洗脫,最后用加入8倍于樹(shù)脂量70%乙醇進(jìn)行洗脫,測(cè)定靜置不同時(shí)間的洗脫液皂苷質(zhì)量比,結(jié)果見(jiàn)圖7.如圖7所示,隨著解析時(shí)間的增加,皂苷量也逐漸增大,在解吸時(shí)間達(dá)到60min后質(zhì)量比無(wú)明顯增加,這時(shí)解吸基本完全,出于對(duì)純化周期的考慮,將最佳解吸時(shí)間定為為60min.

    圖7 解析時(shí)間對(duì)皂苷質(zhì)量比的影響

    4 結(jié)語(yǔ)

    綜上可知,豆角總皂苷純化的最佳工藝條件為:上樣pH值為8,上樣液量為8倍樹(shù)脂體積,吸附70min,依次用蒸餾水、20%乙醇溶液、8倍樹(shù)脂體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫,解析60min后,收集70%乙醇的洗脫液,減壓濃縮后真空干燥得到豆角皂苷純化物.經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂純化后豆角總皂苷純化物的純度為54.61%,比豆角皂苷純度提高了28.47%,為接下來(lái)豆角皂苷的繼續(xù)精制及其結(jié)構(gòu)研究奠定了基礎(chǔ).

    [1]劉清福,梅燕山,梁慧峰.FTIR光譜法定性鑒別有毒豆角[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2002,19(6):816-818.

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    [6]孟 雪,吳 春.大孔樹(shù)脂分離純化玉米苞葉總黃酮方法研究[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2011,27(3):284-286,291.

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