晚期氧化蛋白產(chǎn)物對腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化影響的基礎(chǔ)研究

陳詠梅 鄒世海 陳詠梅 彭 鑫 朱賽香

（深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院血液透析室，廣東 深圳 518101）

腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎功能衰竭的共同病理過程，其嚴(yán)重程度跟很多慢性腎病的預(yù)后密切相關(guān)。腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腎間質(zhì)纖維化的主要機(jī)制之一[1-3]，大量肌成纖維細(xì)胞的生成和肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志性蛋白之一α-SMA的表達(dá)顯著增加。晚期氧化蛋白產(chǎn)物（AOPP）是近年來引起重視的一類與炎癥、氧化應(yīng)激密切相關(guān)的氧化修飾蛋白。尿毒癥時(shí)，腎小管上皮細(xì)胞經(jīng)常面臨多種毒素的損傷。多種尿毒毒素可激活腎小管上皮細(xì)胞。已有研究表明，除大量白蛋白外，多種修飾后蛋白，如：低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白、晚期糖基化終產(chǎn)物等，均可激活腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的表型轉(zhuǎn)分化[4]。本研究通過免疫組化觀察AOPP是否會影響α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）等標(biāo)志物的水平，旨在研究AOPP是否可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞活化，轉(zhuǎn)分化，以及參與腎間質(zhì)炎證、纖維化的過程機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

人血清白蛋白（HAS）購自上海新興，次氯酸購自上海試劑一廠，α-SMA及E-cadherin抗體購自武漢博士德公司，山羊血清、二抗、DAB等試劑購自北京中山公司，F(xiàn)BS，DMEM購自Hyclone公司。

1.2 AOPP-BSA的制備

按文獻(xiàn)報(bào)道[2]方法，將60mg/mLHAS（PBS稀釋）與次氯酸溶液等體積混合，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1h（25～30℃），制備出BSA與次氯酸摩爾比為1∶140的AOPP。制備的AOPP-HAS加入β-巰基乙醇終止反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物軒于超濾管中1000g離心超濾30min，加入適量PBS沖洗，再次離心超濾。AOPP含量通過以氯氨T濃度為標(biāo)準(zhǔn)從酸性條件下340nm的光吸收取得。

1.3 腎小管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)

HK-2細(xì)胞株為人近曲腎小管上皮細(xì)胞株，正常HK-2細(xì)胞使用DMEM+10%FBS培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，于37℃、5%CO2孵箱中生長。經(jīng)Cytokeratin18蛋白染色鑒定證實(shí)為腎小管上皮細(xì)胞后用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞長至80%以上融合時(shí)用0.25%胰酶進(jìn)行消化，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106/mL均勻接種至6孔培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞長至約70%～80%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。加入AOPP分別培養(yǎng)12h、24h、48h，收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4 免疫組織化學(xué)

采用免疫細(xì)胞化學(xué)二步法觀察腎小管上皮細(xì)胞α-SMA及E-cadherin的表達(dá)。收集細(xì)胞爬片，PBS沖洗3次，每次5min，4度4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞10min，PBS洗5min，共3次，3%H2O2處理10min，采用檸檬酸鹽微波修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫后PBS洗5min，共3次，滴加一抗（1∶100稀釋），4℃過夜，次日PBS沖洗5min，共3次后，滴加羊抗兔IgG抗體-HRP，PBS沖洗5min，共3次后滴加DAB顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。PBS代替一抗作陰性對照。結(jié)果判斷：顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并計(jì)數(shù)隨機(jī)視野1000個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 腎小管上皮細(xì)胞α-SMA免疫組化結(jié)果比較

腎小管上皮細(xì)胞α-SMA染色陽性結(jié)果表現(xiàn)為細(xì)胞漿棕黃色顆粒，在正常大鼠中只在血管壁看到α-SMA陽性表達(dá)，近曲小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)無表達(dá)，而在AOPP誘導(dǎo)后，腎小管上皮細(xì)胞中可見到α-SMA弱陽性表達(dá)，表現(xiàn)為胞漿內(nèi)散在的小顆粒，呈染色較淺的淡黃色，多見于脂肪變性的腎小管上皮細(xì)胞；當(dāng)AOPP誘導(dǎo)后，可見α-SMA在腎小管上皮細(xì)胞的陽性表達(dá)率及表達(dá)量均明顯上升，表現(xiàn)為無脂肪變性的腎小管上皮細(xì)胞亦有表達(dá)，且α-SMA陽性細(xì)胞胞漿中可見大量棕黃色顆粒。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，AOPP誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞后，α-SMA的陽性表達(dá)率較對照組均有顯著上升（表1）。

2.2 腎小管上皮細(xì)胞E-cadherin免疫組化結(jié)果比較

腎小管上皮細(xì)胞E-cadherin染色陽性結(jié)果表現(xiàn)為胞膜及胞漿染成棕黃色，在正常大鼠中可見E-cadherin呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而在AOPP誘導(dǎo)后，腎小管上皮細(xì)胞中可見到E-cadherin弱陽性表達(dá)，表現(xiàn)為胞漿內(nèi)散在的小顆粒，呈染色較淺的淡黃色；當(dāng)AOPP誘導(dǎo)后，可見E-cadherin在腎小管上皮細(xì)胞的陽性表達(dá)率及表達(dá)量均顯著下降（表2）。

表1 AOPP對HK-2細(xì)胞α-SMA表達(dá)的影響[（±s），n=3]

表1 AOPP對HK-2細(xì)胞α-SMA表達(dá)的影響[（±s），n=3]

注：與對照組比較，*P＜0.05；**P＜0.01

組別α-SMA陽性率對照11.6±3.5 12h23.7±5.8*24h39.3±4.5**48h53.4±6.2**

表2 AOPP對HK-2細(xì)胞E-cadherin表達(dá)的影響[（±s），n=3]

表2 AOPP對HK-2細(xì)胞E-cadherin表達(dá)的影響[（±s），n=3]

注：與對照組比較，* P＜0.05；** P＜0.01

組別E-cadherin陽性率對照42.6±4.9 12h28.2±4.2*24h23.4±3.7**48h18.6±1.7**

3 討 論

“腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化”這個(gè)概念于1994年首先提出并得到多名學(xué)者的研究結(jié)果證實(shí)[5]。EMT時(shí)發(fā)生的四個(gè)關(guān)鍵步驟依次為：上皮黏附特性消失、α平滑肌肌動蛋白表達(dá)、突破基底膜、細(xì)胞遷移并入侵間質(zhì)。腎小管上皮細(xì)胞EMT的起始步驟為E-cadherin的喪失。作為一種細(xì)胞間黏附連接蛋白，E-cadherin的主要作用是介導(dǎo)同種細(xì)胞間的黏附反應(yīng)及參與建立和維持正常細(xì)胞間的連接[6]。它的喪失會引起形成緊密連接的相鄰細(xì)胞間的緊密連接消失，細(xì)胞極性消失，出現(xiàn)表型改變。本文的研究結(jié)果顯示：隨AOPP刺激時(shí)間的延長，HK-2細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)逐漸減少而α平滑肌肌動蛋白的表達(dá)，這一過程參與轉(zhuǎn)分化過程。因此AOPP是一種新的具有氧化應(yīng)激活性的尿毒癥毒素，慢性腎功能衰竭的治療應(yīng)著眼于如何有效降低患者血漿中的AOPP水平。

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